José Silva/李欢欢团队实现小鼠桑椹胚样全潜能细胞的体外培养 | Cell Press对话科学家
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2023年10月23日，广州实验室的José Silva/李欢欢科研团队在Cell Press细胞出版社期刊Developmental Cell发表了题为“In vitro Generation of Mouse Morula-like Cells”的研究成果，首次在体外制备了小鼠桑椹胚样全潜能细胞，该细胞在分子水平及发育潜能上均具有自然胚胎桑椹期细胞的特性，并成功利用该单一细胞群在体外制备可模拟原肠运动期小鼠胚胎的合成胚胎，为体外模拟生命事件打下坚实基础，具有深远的生物学意义。
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相关背景
长久以来，发育生物学家致力于解码早期生命发育关键事件。但是，受限于伦理及早期胚胎取材困难等因素，着床前后的胚胎发育事件仍是尚待探索的“黑匣子“，这促使了科学家们开发体外胚胎模型以重现该阶段的自然胚胎发育[1]。因此，获得具有模拟自然胚胎发育能力的细胞具有重大生物学意义。
受精卵在经历一系列卵裂、分化、原肠运动、器官发生等事件后发育为完整胎儿。卵裂球胚胎，即2细胞至16细胞期胚胎，被认为具有发育全潜能性，即该时期内胚胎细胞具有发育成囊胚内的滋养外胚层（Trophectoderm）和内细胞团（Inner Cell Mass）的能力，ICM则进一步发育成上胚层（Epiblast）与原始内胚层（Primitive Endoderm）。
结果解读
1.首次成功体外获取小鼠桑椹胚样细胞（MLC）
作者发现STAT3信号通路在早期胚胎发育（2细胞至囊胚期）具有关键的作用，基于此，作者通过提高pSTAT3表达水平，将小鼠胚胎干细胞重置至胚胎发育更初始状态：桑葚胚期（8-16细胞期），并将该种细胞命名为Mouse Morula-like cells (MLC)。MLC在在分子水平上与现有报道的扩潜能/多潜能/二细胞样细胞[2,3,4]不同，而与桑葚胚期细胞表现一致，揭示了MLC是一种全新的体外制备细胞类型。特别地，研究人员发现MLC中明显上调的事情包括Electron transport chain，Oxidative phosphorylation，表明了非常早期胚胎发育的基因被激活。综上，研究人员证明了MLC是一种全新的体外细胞类型，并在分子学水平上与自然桑椹期胚胎相似（图1）。
图1 体外制备桑葚胚样细胞。
（A）技术路线；（B）ipSTAT3 激活Gata6表达；（C）单细胞测序分析MLC、ESC与体内早期胚胎
2.MLC具有体外合成胚胎发育全潜能性
为了阐明MLC是否具有胚胎发育全能性，作者们利用多种体外胚胎体系以验证MLC的发育潜能。结果表明，MLC不仅能响应环境内的信号刺激并分化为三种早期胚胎谱系细胞，且能高效地形成类囊胚Blastoids，揭示了MLC具有能比拟Blastomere（卵裂球）胚胎的发育能力。近年来，世界各国科学家在体外构建模拟哺乳动物早期胚胎发育模型取得了长足进展，发表了数篇在体外支持胚胎发育及构建体外合成胚胎模型的重要成果[5,6]。然而，目前体外制备类胚胎的体系，需要按一定比例聚合三种早期胚胎谱系，即滋养外胚层、上胚层与原始内胚层样细胞，该方法仍与自然胚胎卵裂分化过程存在一定差异。由此，基于MLC所展现的贴合自然胚胎全潜能性的特质，作者们提出，单一MLC细胞群或能够在体外制备具有近着床后胚胎发育能力的类胚胎（Embryoids）。令人惊喜的是，如同作者们的设想，MLC并不需要聚合多种谱系细胞便可制备结构完整的类胚胎，进一步地，单细胞测序结合免疫荧光结果表明，MLC类胚胎非常贴合原肠运动时期E7.0自然胚胎（图2）。
图2 单一MLC细胞群足以制备类胚胎。
（A）制备MLC来源的类胚胎的方法梗概；（B）MLC来源的类胚胎五天内发育情况的代表性明场图；（C）D3与D4的MLC来源类胚胎的代表性免疫荧光图，比例尺，50um。
3.MLC具有体内发育全潜能性
为了更完整探究MLC的全发育潜能性，研究人员将MLC注入小鼠8细胞期的胚胎内以检测其体内发育全潜能性。同样地，通过单细胞测序分析及免疫荧光检测，研究人员证明了MLC在小鼠体内同样具有发育成三个早期胚胎谱系的能力，并能够产生健康嵌合体小鼠（图3）。
图3 MLC在体内展现发育全潜能性。
（A）探究MLC在注射入8细胞期胚胎后的发育潜能实验设计；（B）MLC来源的嵌合体胚胎的代表性明场及荧光图；（C）MLC来源的嵌合体胚胎的代表性免疫荧光图；(D)MLC嵌合小鼠的代表性图。
总结
综上，该研究在体外制备了具有真正发育全潜能性的细胞：桑椹胚样细胞（MLC），并通过不同手段检验了MLC的发育能力（图4）。MLC不仅为我们深入探究体外胚胎发育的复杂性提供了崭新的研究手段，其特有的发育潜能将为再生医学领域提供新鲜血液，具有重要的生物医学价值。
图4. MLC总结图。
广州实验室José Silva为论文通讯作者，李欢欢为论文第一作者及共通讯作者，广州实验室吴光明、闵明玮、张满，中国科学院陈捷凯，南方科技大学Andrew P. Hutchins等联合署名。该研究得到国家自然科学基金青年项目（32100653），广东省科技厅重大项目（2021ZT09Y233），广州市科技局基础研究项目（20220101089）和深圳市科技创新项目（ZDSYS20200811144002008）等资助。
参考文献
[1] Amadei, G., Handford, C.E., Qiu, C., De Jonghe, J., Greenfeld, H., Tran, M., Martin, B.K., Chen, D.Y., Aguilera-Castrejon, A., Hanna, J.H., et al. (2022). Embryo model completes gastrulation to neurulation and organogenesis. Nature 610, 143-153. 10.1038/s41586-022-05246-3.
[2] Yang, J., Ryan, D.J., Wang, W., Tsang, J.C., Lan, G., Masaki, H., Gao, X., Antunes, L., Yu, Y., Zhu, Z., et al. (2017). Establishment of mouse expanded potential stem cells. Nature 550, 393-397. 10.1038/nature24052.
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[4] Fu, X., Djekidel, M.N., and Zhang, Y. (2020). A transcriptional roadmap for 2C-like-to-pluripotent state transition. Sci Adv 6, eaay5181. 10.1126/sciadv.aay5181.
[5] Weatherbee, B.A.T., Gantner, C.W., Iwamoto-Stohl, L.K., Daza, R.M., Hamazaki, N., Shendure, J., and Zernicka-Goetz, M. (2023). Pluripotent stem cell-derived model of the post-implantation human embryo. Nature. 10.1038/s41586-023-06368-y.
[6] Liu, L., Oura, S., Markham, Z., Hamilton, J.N., Skory, R.M., Li, L., Sakurai, M., Wang, L., Pinzon-Arteaga, C.A., Plachta, N., Hon, G.C., and Wu, J. (2023). Modeling post-implantation stages of human development into early organogenesis with stem-cell-derived peri-gastruloids. Cell 186, 1–17. 10.1016/j.cell.2023.07.018.
作者专访
Cell Press细胞出版社特别邀请李欢欢副研究员进行了专访，请她为大家进一步详细解读。
CellPress：
该研究的主要亮点有什么？
李欢欢副研究员：
我们首次在体外制备了具有可比拟自然桑葚胚的细胞。仅利用单一MLC细胞群制备可以模拟早期小鼠着床前后胚胎发育的类胚胎，与现有的多谱系细胞聚合的方法不同，并通过多种手段检测证明该种方法制备的类胚胎不仅在形态学上与自然胚胎近似，且具有自然胚胎的分子学特征。特别地，我们的MLC类胚胎具有发育到贴合原肠运动时期E7.0自然胚胎的能力。综上，我们的MLC是一种在体内及体外均具有发育全潜能性的体外细胞类型。
CellPress：
MLC是像ESC一样可不断自我更新的细胞群吗？
李欢欢副研究员：
MLC是一种瞬时的，具有自然小鼠8细胞到16细胞期胚胎特征的细胞群，其具有相互制约的转录因子的共表达（如Nanog和Gata6）。这种瞬时的特性同样在自然早期胚胎中被观察到，即我们无法捕获桑椹期胚胎细胞并使之保持桑椹期胚胎细胞特性而停止分化发育，这进一步说明我们的MLC非常贴合早期胚胎细胞特性。
CellPress：
制备发育至原肠运动期的胚胎用时需要多久呢？
李欢欢副研究员：
MLC具有真正的发育全潜能性。单一的MLC细胞群仅仅在4天内即可以发育至具有贴合自然胚胎E7.0阶段的胚胎，并同时具有胚内及胚外组织。
CellPress：
对于该全新技术或相关领域的未来展望有什么呢？
李欢欢副研究员：
探索胚胎发育过程、推动干细胞再生与组织器官的功能重建，是未来更好地理解发育及各种发育疾病的的关键突破口。基于MLC的获得，我们的团队仍在积极地优化体外合成胚胎系统，希望能够尽快将该研究成果转化成临床技术，以获得更广泛的应用。随着合成胚胎技术的进一步发展和优化，科学家有望在未来获得功能性细胞，推动再生医学。
作者介绍
JOSÉ SILVA
研究员
JOSÉ SILVA，广州实验室研究员，博士生导师，来华工作前以资深独立研究员任职于剑桥大学干细胞研究所，专注于细胞命运转变的研究，是干细胞与再生研究领域的领军人物之一，以通讯作者身份在Nature、Cell、Cell Stem Cell、Developmental Cell、Nature Cell Biology等国际顶级学术期刊发表高影响力论文30余篇；论文总引用次数超过12000次。曾获2008年新一代干细胞研究奖，2009年维康信托基金学者奖，2013年维康信托基金资深学者奖。获得2021年度国家重大人才项目及广东省高层次人才项目。
李欢欢
副研究员
李欢欢，广州实验室副研究员，2017年博士毕业于中国科学院大学细胞生物学专业。2018年至2021年在瑞士弗雷德里希·米歇尔生物医学研究所（FMI）开展博士后研究工作，致力于全能性细胞获得、合成胚胎构建、多能干细胞诱导及胚胎早期发育方向的研究。所建立的合成胚胎系统具有较大的创新性和独具优势，已在国际干细胞会议进行汇报，得到同行的一致认可。近年来，以第一作者或共通讯在Cell Stem Cell、Developmental cell、Science Bulletin等期刊上发表论文。目前，主持国家自然科学基金青年基金项目，广州市科技计划项目，并参与瑞士国家自然科学基金等项目。以项目“细胞命运决定的多维染色质层级调控”获2022年度广东省科学技术奖自然科学奖一等奖。
相关论文信息
论文原文刊载于Cell Press细胞出版社旗下期刊
Developmental Cell上，点击“阅读原文”或扫描下方二维码查看论文
▌论文标题：
In vitro generation of mouse morula-like cells
▌论文网址：
https://www.cell.com/developmental-cell/fulltext/S1534-5807(23)00519-1
▌DOI：
https://doi.org/10.1016/j.devcel.2023.09.013
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