动物所王昱凯述评：人胚胎干细胞来源的多巴胺神经前体细胞治疗帕金森病的临床前评价 | Cell Press青促会述评

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作为世界领先的全科学领域学术出版社，细胞出版社特与“中国科学院青年创新促进会”合作开设“青促会述评”专栏，以期增进学术互动，促进国际交流。

2023年第三十期（总第158期）专栏文章，由中国科学院动物研究所副研究员、北京干细胞与再生医学研究院研究员 王昱凯，就 Cell Stem Cell中的论文发表述评。

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帕金森病（PD）的细胞治疗是再生医学领域的前沿方向之一。早在30多年前，胎儿中脑组织移植的临床试验就证实了细胞替代疗法的可行性和持久性，正电子发射断层扫描（PET）和尸检显示移植物可以存活超过20年，而且纹状体区有多巴胺能神经支配的恢复，部分患者甚至完全停止口服左旋多巴药物。然而，移植物仅在少数病例中产生显著的治疗效果，且其中混杂的五羟色胺神经元使个别病例产生了严重副作用，阻碍了该细胞疗法的临床进程。目前，领域内普遍认为原代组织的个体和批次差异导致的细胞质量控制和标准化缺乏是其中的关键问题。基于近年来多能干细胞分化技术的突破性进展，国际上多个团队建立了高效的中脑多巴胺能神经前体细胞（mDAP）分化体系，有望为临床应用提供更可靠的细胞来源。现阶段，细胞的质量控制和临床前评价是该领域多个团队的主要研究任务。

2023年12月11日，韩国延世大学Dong-Wook Kim课题组和韩国高丽大学Dae-Sung Kim课题组合作在Cell Press细胞出版社期刊Cell Stem Cell 在线发表了题为“Preclinical and dose-ranging assessment of hESC-derived dopaminergic progenitors for a clinical trial on Parkinson’s disease”的研究论文，报告了一项人胚胎干细胞（hESC）分化的mDAP的临床前研究结果。该研究在GMP条件下对临床级hESC系进行扩增建库，随后使用特定小分子和无动物源的培养体系诱导神经分化，获得了高纯度的mDAP并完成了质量检测和体内安全性与有效性评价，所开发的细胞制备和移植策略将为临床研究的开展提供有力支持。

▲图1 GMP条件下mDAP的生产流程和标志物表征。(A) hESC分化mDAP的生产流程示意图。(B) 对分化第19天（对应WCB）和25天（对应终产品）的mDAP进行免疫荧光染色分析。细胞高比例表达mDAP标志物FOXA2、LMX1A、OTX2，不表达多能性标志物SSEA-4或OCT4。标尺=20 μm。

图1展示了细胞分化流程和关键质控节点，研究者采用了单层细胞神经诱导、悬浮分化、重新贴壁诱导mDAP、手动分离纯化mDAP和扩增的方法，在经历4个阶段和25天的分化培养后，可以完成终产品制备（图1A）。其中，分化第19天的细胞被用于创建工作细胞库（WCB），可进行批量化生产和冻存，结合免疫荧光染色等检测，可以实现较好的细胞质量控制，减少终产品的批次差异。结果表明，mDAP主要标志物均有高比例的表达（图1B），而且细胞可以进一步分化成熟并分泌多巴胺递质。这一规范化的生产和检测流程确保了质量稳定可控的细胞产品的制备。

为了探究细胞终产品的体内生物学功能，作者在GLP条件下制备了PD大鼠模型，将3.5×10⁵细胞植入到损伤侧纹状体中，16周后可检测到运动能力的显著恢复（图2A）。PET影像结果表明，细胞移植后纹状体区多巴胺合成功能显著增强。高效液相色谱分析也发现移植部位多巴胺水平恢复到健侧的41.1%。组化检测显示移植细胞富含TH+的多巴胺能神经元，与mDAP标志物FOXA2、LMX1A，以及成熟多巴胺能神经元标志物PITX3有共定位，且A9亚型标志物GIRK2+的细胞（84.65% ± 14.24%）多于A10亚型CALB+的细胞（36.18% ± 23.17%）（图2B-F）。作者也对常见的杂质细胞进行了检测，发现GFAP+星形胶质细胞、5-HT+的五羟色胺能神经元和GAD65+的GABA能神经元占比均小于1%，部分移植物中发现少量COL1A1+血管软脑膜细胞和TTR+脉络丛上皮细胞，未发现移植物有过度增殖迹象。以上结果表明，移植的mDAP可以在PD大鼠模型纹状体内产生成熟且有功能的多巴胺能神经元。

▲图2 mDAP终产品在PD大鼠模型中的治疗效果研究。(A)细胞移植前1周和给药后16周进行安非他明诱导的旋转测试。(B)细胞移植后16周时宿主纹状体内TH的免疫组化染色图。(C–E)细胞移植后16周时，移植物中mDAP标志物的免疫荧光分析，比例尺，20 μm。(F)细胞移植后16周，移植物中GIRK2（绿色）和CALB（红色）与TH（蓝色）的共定位情况。比例尺，20 μm。

为了明确细胞移植量与行为改善的效应关系，也为了探索能起到治疗效果的最低剂量，研究者重新设置了4个不同的剂量组，包括5×10³、1×10⁴、2.5×10⁴、1×10⁵个细胞/动物。24周实验结束时，移植5×10³个细胞的动物未能表现出明显的改善，移植1×10⁴、2.5×10⁴、1×10⁵个细胞的动物分别在24周、20周和12周时表现出显著下降。说明移植1×10⁴个或更多的细胞可以引起行为恢复，并且细胞数量越高恢复效果越早、越强。统计数据还展示了背侧纹状体中多巴胺能神经纤维体积、细胞存活数量与效果的相关性，反映出细胞剂量与行为改善之间存在明确的量效关系。研究者进一步在裸鼠体内研究了细胞的毒理、生物分布和致瘤性。

这项研究展示了用于PD治疗的细胞制备工艺、质量属性、临床前安全性和有效性评估数据，基于以上结果，研究者团队在韩国发起了一项单中心、开放标签、剂量递增的1/2a期临床试验（NCT05887466），该项目受到韩国细胞疗法公司S.Biomedics的支持。目前团队正在招募3名低剂量组（3.15×10⁶个细胞/人）患者来评估安全性，如果在3个月内没有出现安全问题，将另外招募3名患者接受高剂量（6.3×10⁶个细胞/人）移植，如果3个月内仍然不存在安全问题，将继续在2个剂量组各增加3名患者（共12名患者）。

综上，该论文通过hESC定向分化的方法，建立了一种高效、均一的mDAP分化工艺和生产流程，制备了符合当地干细胞成药要求的可用于临床的mDAP制剂，并在动物模型上充分验证了其安全性和有效性。目前，该领域来自美国、欧洲和亚洲的多个团队都陆续公开了细胞分化策略和体内外安全性、有效性的数据，部分研究已进入临床试验阶段。作为韩国基于hESC的首个进入临床试验的研究，此细胞产品的相关数据显示出较高的竞争力。然而，该体系的细胞分化过程略显复杂，而且最终移植的是新鲜细胞，虽然在提高体内存活率方面具有优势，但从商业化和安全性风险的角度看，相比于其他团队的现货型细胞制剂策略还存在一定的局限性。

论文摘要

人胚胎干细胞（hESC）来源的中脑多巴胺能（mDA）细胞移植是治疗帕金森病（PD）的一种有前途的治疗策略。在这里，我们展示了在严格的良好生产规范 (GMP) 条件下从临床级 hESC 大规模分化高纯度 mDA 祖细胞的方法。我们还在符合良好实验室规范 (GLP) 的设施中，用免疫缺陷大鼠评估了这些细胞的体内毒性、生物分布以及致瘤性。将不同剂量的 mDA 祖细胞移植到单侧PD大鼠模型脑内，在mDA祖细胞的最小有效剂量范围内（5,000-10,000个细胞）观察到显著的剂量依赖性运动改善。这些结果为确定人体临床试验的最低细胞剂量（315万个细胞）提供了依据。基于这些结果，PD细胞疗法的1/2a期临床试验获得韩国食品药品安全部的批准，相关临床试验已经开启。

Human embryonic stem cell (hESC)-derived midbrain dopaminergic (mDA) cell transplantation is a promising therapeutic strategy for Parkinson’s disease (PD). Here, we present the derivation of high-purity mDA progenitors from clinical-grade hESCs on a large scale under rigorous good manufacturing practice (GMP) conditions. We also assessed the toxicity, biodistribution, and tumorigenicity of these cells in immunodeficient rats in good laboratory practice (GLP)-compliant facilities. Various doses of mDA progenitors were transplanted into hemi-parkinsonian rats, and a significant dose-dependent behavioral improvement was observed with a minimal effective dose range of 5,000–10,000 mDA progenitor cells. These results provided insights into determining a low cell dosage (3.15 million cells) for human clinical trials. Based on these results, approval for a phase 1/2a clinical trial for PD cell therapy was obtained from the Ministry of Food and Drug Safety in Korea, and a clinical trial for treating patients with PD has commenced.

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述评人简介

王昱凯

中国科学院动物研究所副研究员

北京干细胞与再生医学研究院研究员

中国科学院特聘研究岗位

[e-mail]

王昱凯，中国科学院动物研究所副研究员，北京干细胞与再生医学研究院研究员，中国科学院特聘研究岗位。主要从事干细胞命运调控与神经再生研究，在细胞命运调控机制及神经细胞治疗产品的应用研究方面取得了系列成果。以第一/通讯作者（含共同）在Cell，Cell reports，Cell discovery，Cell proliferation等期刊发表SCI论文20余篇，成果入选2019年度“中国生命科学十大进展”，合作开展了细胞治疗帕金森病的临床研究并受Nature专题报道，获“中国科学院稳定支持基础研究领域青年团队计划”项目资助，担任Stroke & Vascular Neurology期刊审委。

Yukai Wang, Ph.D., associate professor in Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences; professor in Beijing Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine. Dr. Wang engaged in the study of stem cell fate regulation and nerve regeneration. He has published more than 20 SCI papers in Cell, Cell reports, Cell discovery, Cell proliferation, etc. as the first/corresponding author (including co-authors), and his work has been selected as one of the "Top Ten Advances in China's Life Sciences" in 2019. He has cooperated in the clinical research of cell therapy for Parkinson's disease and received a special report from Nature. He was funded by the "CAS Project for Young Scientists in Basic Research", and has been selected as one of the Review Board Member of Stroke & Vascular Neurology.

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相关论文信息

原文刊载于CellPress细胞出版社旗下期刊 Cell Stem Cell 上，点击“阅读原文”或扫描下方二维码查看论文

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