藿香正气散在寒湿困脾型腹泻中的治疗潜力：对肠道微生物群调节和消化酶活性的见解 | Heliyon编辑精选

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腹泻作为一个常见的症状，通常使用抗生素类消炎药进行治疗，但有些腹泻可能是胃肠道功能紊乱、吸收障碍、病毒感染，所引起的，服用抗生素并不能起到很好的效果。藿香正气散原方出自宋代《太平惠民和剂局方》，后代逐渐出现藿香正气水，霍香正气丸（浓缩丸、水丸），藿香正气胶囊（软胶囊），藿香正气口服液，藿香正气颗粒和藿香正气滴丸等新剂型。明代医家吴琨曾在《医方考》一书中曰：“四时不正之气，不在表而在里，皆由中气不足者受之，故不用大汗以解表，但用芳香利气之品以正里。”藿香正气散为千古名方，其临床治疗中运用颇多，而饮食所伤需要醒脾，藿香正气散恰能对证。文章“Unlocking the therapeutic potential of Huoxiang Zhengqi San in cold and high humidity-induced diarrhea: Insights into intestinal microbiota modulation and digestive enzyme activity”深入探讨了其在小鼠中的治疗机制，验证了藿香正气散通过调节肠道菌群、消化酶活性和菌群相互作用，有效缓解寒湿困脾型腹泻的作用机理。文章于2024年6月12日发表于Cell Press细胞出版社旗下Heliyon期刊上。

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【摘要】

藿香正气散是一种传统的中草药配方，广泛用于治疗寒湿困脾型腹泻（CDSS）。本研究探讨了其在小鼠中的治疗机制，将40只雄性SPF级KM小鼠分为两组：对照组（H-Cc，n = 10）和CDSS组（H-Mc，n = 30）。建模后，H-Mc进一步细分为H-Mc（n=15）和藿香正气散处理组（H-Tc，n=15），分析肠道样本的酶活性和微生物群组成。研究结果表明，藿香正气散治疗后肠道乳糖酶活性显著降低（P < 0.05）。Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus reuteri和Lactobacillus murinus成为主要优势菌种。而在H-Mc组中， Clostridium sensu stricto 1是唯一的优势菌。LEfSe分析显示Clostridiales vadinBB60组和Corynebacterium是 H-Tc 组中的差异细菌，H-Tc组为蓝藻未鉴定物种。预测的微生物群功能与丰度变化一致。肠道菌群相互作用网络的共线结果显示，藿香正气散通过缓解稀有菌之间的相互促进，恢复了他们的协同作用。藿香正气散通过调节肠道菌群、消化酶活性和菌群相互作用，有效缓解CDSS腹泻。藿香正气散在增强Clostridium vadinBB60和抑制蓝藻未识别的物种中的作用需要进一步研究。

【文章简介】

在传统中医中，CDSS是一种由暴露于寒冷潮湿环境引发的腹泻，是中医中六种最常见的综合征型腹泻之一。CDSS腹泻的发病机制涉及源自寒冷和潮湿环境的外部应激源，这些应激源阻碍了脾脏的运输和转化功能，从而导致腹泻。

藿香正气散是一种用于治疗CDSS腹泻的经典中药方剂，由13种中草药组成。在中医理论中，每种疾病都表现出特定的病理和症状模式，而不同的中药处方则表现出不同的药理性质和治疗效果。根据这一原理，藿香正气散不但可以用于治疗 CDSS 疾病，对治疗新型冠状病毒肺炎、功能性消化不良、呕吐和中暑也有疗效。然而，由于藿香正气散的组成复杂且治疗靶点多，研究人员难以在疗效方面取得重大突破。

中草药成分通常在进入肠道时被肠道菌群转化，而不是直接被宿主吸收。中草药与肠道菌群之间的这种密切关系主要体现在两个方面：首先，中草药中的碳水化合物、蛋白质、脂质和小分子非营养性化合物在进入肠道后，被肠道菌群转化为活性代谢产物，直接影响中药的治疗效果；其次，活性代谢产物可以调节肠道菌群的组成，进而影响肠道健康。药理学研究表明，藿香正气散在治疗功能性消化不良方面有23个靶点外，其余只有5个能直接进入血液。这表明处方中的大多数活性成分可能需要通过肠道微生物群转化为活性代谢物来治疗疾病。

本研究利用藿香正气散治疗CDSS小鼠腹泻，对肠黏膜和内容物的DEA进行分析，并对肠内容物内微生物群落的多样性、结构、差异分析、功能预测和协同动力学进行综合分析，以探讨藿香正气散的肠道微生态作用机制。

【材料与方法】

藿香正气散汤的制备

将药剂混合物在水中浸泡30分钟后，煎煮两次，每次约30分钟。所得溶液通过双层纱布过滤，然后在水浴中浓缩，达到0.24 g/mL的粗药浓度。最后，将浓缩物储存在4°C的冰箱中。

动物和群体

本研究使用40只雄性SPF级KM小鼠。经过三天的适应期后，小鼠被随机分配到两组：正常对照组（H-Cc，n = 10）和腹泻CDSS组（H-Mc，n = 30）。成功建模后，H-Mc组进一步分为两个亚组，H-Mc组（n = 15）和藿香正气散处理组（H-Tc，n = 15）。

实验设计和观察

建模阶段：根据既定方案建立了表现出腹泻和 CDSS 的小鼠模型。模型组小鼠连续7天每天早晨8：00至12：00暴露于（4 ± 0.5）°C和（90 ± 2）%湿度的环境室中，期间无限量饮水禁食。H-Cc组维持在温度范围为23 °C-25 °C，相对湿度为47 %-53 %的标准环境中，其他条件与模型组相同。

中医治疗阶段：造模阶段后，小鼠进一步随机分为H-Tc组和H-Mc组。H-Tc组给予藿香正气散汤剂，H-Mc和H-Cc组给予蒸馏水，每天早晚各灌胃一次，连续3天，每次灌胃0.35 mL。每天在固定时间观察并记录小鼠的行为和特征，并观察粪便形态。根据滤纸上湿圈的大小对小鼠腹泻程度进行分级，计算腹泻指数。

样品收集和检测

治疗后，每组选取5只小鼠，通过脱颈处死，在超洁净手术台上取出小肠标本。收集肠内容物并相应标记：H-Cc 1-5、H-Mc 1-5、H-Tc 1-5。在测序之前，样品将保存在-80℃。使用ONPG测定法测定乳糖酶活性。DNS法用于测量淀粉酶、纤维素酶和蔗糖酶活性，Folin苯酚法检测蛋白酶活性。使用分光光度计量化了不同消化酶的活性水平。

PCR扩增和illumina hiSeq测序

使用明治试剂盒从收集的样品中提取微生物DNA，评估其数量和质量。使用正向引物27F（5′-AGRGTTYGATYGATYMTGGCTCAG-3′）和反向引物1492R（5′-RGYTACCTTGTTACGACTT-3′）对细菌全长16S rRNA 基因进行PCR扩增，随后对PCR产物进行纯化和定量。

【结果】

藿香正气散对CDSS腹泻小鼠肠道消化酶的影响 

在实验过程中，与H-CC组相比，暴露在寒冷潮湿环境中的小鼠粪便湿软，大便频率增加，并表现出不适和毛发凌乱的迹象。然而，这些症状在用藿香正气散治疗后得到缓解。图1显示了每组中肠道消化酶的水平，与H-Mc组相比，H-Tc组的肠内容物乳糖酶活性显著降低（P<0.05），蔗糖酶活性略低（P>0.05），随后恢复正常。相反，H-Tc组的肠道内容物中蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活性水平升高，也恢复到正常水平（P>0.05）。与H-Mc组相比，H-Tc组的肠粘膜乳糖酶、黏膜蔗糖酶和纤维素酶活性水平更高（P>0.05）。然而，两组肠黏膜蛋白酶活性无显著差异（P>0.05）。

图1 肠内容物和粘膜中的DEA。A-E：分别是肠内容物中乳糖酶、蔗糖酶、蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶的活性。F–I：分别是肠粘膜中乳糖酶、蔗糖酶、蛋白酶和纤维素酶的活性。数据以平均值±标准差 （SD） 表示。* P < 0.05， *** P < 0.001. 

藿香正气散对CDSS腹泻小鼠肠道菌群多样性的影响

稀释曲线分析（图2A）表明测序数据量足以进行后续分析。共获得135158个高质量细菌16SrRNA序列，分布如下：H-Cc组4052个，H-Mc组43606个，H-Tc组47500个。如图2B所示，三组共共享72个OTU。此外，还鉴定了独特的OTU：H-Cc组有43个，H-Mc组有52个，H-Tc组有61个。图2C显示，3组α多样性变化极小，表明H-Mc和H-Tc组肠道菌群的物种丰度、均匀度和多样性逐渐恢复。然而，图2D和E显示H-Tc组与其他组相比存在显著差异，突出了藿香正气散干预对小鼠肠道微生物群组成的实质性影响。

图2 肠道菌群的多样性和群落结构。答：稀释曲线。B：心烦意乱图。C：Alpha多样性指数图，包括丰富度、良好覆盖率、Shannon、Simpson、Chao1和ACE指数。D：基于Bray-Curtis距离的主成分分析（PCA）图。E：偏最小二乘判别分析（PLS-DA）图。 

使用藿香正气散进行CDSS干预的腹泻小鼠肠道菌群合作模式的变化 

如图3A和C所示，建模导致肠道益生菌Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus reuteri和Lactobacillus murinus之间存在竞争和抑制关系。然而，在用藿香正气散处理后，它们之间的抑制性竞争消失了（图3B和C）。同样的变化也发生在稀有菌身上，藿香正气散通过减缓稀有菌之间的密集相互促进，恢复了它们之间原有的合作模式。

图3. 肠道菌群相互作用网络。A：网络描绘了H-Cc和H-Mc组肠道中稀有和丰富物种之间的相互作用。B：说明H-Cc和H-Tc组肠道中稀有和丰富物种之间相互作用的网络。C：显示H-Mc和H-Tc组肠道中稀有和丰富物种之间相互作用的网络。红色节点表示稀有物种的存在，而绿色节点表示丰富的物种;节点大小与其各自的权重成正比。物种之间的相关性用边表示：红线表示正相关，而绿线表示负相关。线的粗细对应于相关性的强度，连接表示强相关性（r>0.8）和统计学显著性（P<0.05）。（有关此图例中对颜色的引用的解释，读者请参阅本文的Web版本)

【讨论与结论】

藿香正气散改善CDSS腹泻小鼠肠道菌群 

藿香正气散主要提高并恢复了L. reuteri的存在，同时减少了L. murinus的过度增殖。据报道，由于抗生素的使用，L. murinus会破坏肠道代谢功能，导致小鼠脱发等疾病。然而，据报道，L. murinus可以预防肠道损伤。在能量有限的条件下，L. murinus生长迅速，有助于维持肠道屏障功能、降低血清内毒素负荷和改善全身炎症。L. reuteri被认为是一种有益细菌，可增强肠道微生物群并对抗有害细菌的定植。此外，它还能抑制肠道炎症因子，增强肠道免疫功能。

在H-Mc组小鼠的肠道中观察到蓝藻未识别物种的增加，而藿香正气散处理显著降低了H-Mc组中一种蓝藻未鉴定物种的丰度，表明其对肠道菌群的潜在影响。

藿香正气散对CDSS腹泻小鼠肠道DEA、肠道微生物丰度和功能的影响

藿香正气散显著降低了肠道内容物中的乳糖酶活性，并且还适度增加了肠粘膜中的二糖酶活性，包括蔗糖酶和乳糖酶，这种增强有助于促进肠道消化功能。藿香正气散增加了CDSS腹泻小鼠内容物中的蛋白酶活性，小肠蛋白酶会对饮食抗原的免疫反应产生负面影响，损害粘膜屏障的完整性，并触发促炎或促伤害信号。蛋白酶活性的增加也可能与肠道炎症和微生物群失调有关。在炎症性肠病患者的粪便中观察到的蛋白酶活性增加表明，在这些情况下，与肠道菌群失调存在潜在联系。此外，藿香正气散被发现可以增强肠道纤维素酶的活性，而肠道纤维素酶负责分解纤维素等复合碳水化合物。这些发现表明，藿香正气散可能有助于改善患有CDSS的腹泻小鼠对碳水化合物的消化和吸收。总体而言，本研究为藿香正气散在增强肠道DEA以及微生物丰度和功能方面的潜在益处提供了宝贵的见解，这些小鼠患有由寒冷和高湿度应激引起的腹泻。

这一发现意味着藿香正气散可以提高小肠内碳水化合物的消化和吸收效率，可能有助于其对肠道健康的整体积极影响。有必要进一步研究藿香正气散在肠道微生物代谢方面的潜在机制和潜在的治疗应用。

藿香正气散调节肠道菌群相互作用可改善CDSS腹泻患者的肠道健康 

肠道中的微生物生态系统是一个动态而复杂的过程，肠道微生物群之间有着错综复杂的交流以适应环境。了解这些微生物相互作用有助于确定肠道微生物群的整体调节和药物对特定细菌的靶向调节。

当受到极端寒冷和潮湿的环境压力时，肠道细菌会改变合作方式以适应新环境，导致微生物群失衡并导致CDSS腹泻。然而，藿香正气散可以恢复肠道菌群的配合，将其恢复到建模前的状态。藿香正气散主要改善了几种优势菌株在肠道内的竞争或抑制策略，同时降低了主要肠道稀有菌的相互促进策略。细菌相互作用的这种有益变化主要归因于藿香正气散改善了肠道中营养物质和能量的分布。然而，肠道细菌之间的合作是复杂的，但目前对共培养微生物之间生态关系的分子机制知之甚少，共培养技术发展缓慢。研究结果表明，藿香正气散可能在调节微生物群合作和增强肠道微生物组健康方面至关重要。需要更多的研究来探索藿香正气散在肠道微生物代谢中的临床应用，并揭示其有益作用背后的机制。

【结论】

本研究揭示了藿香正气散在调节肠道乳糖酶活性和恢复小鼠CDSS腹泻中微生物群平衡的治疗潜力。此外，研究结果强调了藿香正气散将肠道中稀有和丰富细菌之间的共生关系恢复到建模前水平的能力。至关重要的是，藿香正气散直接靶向和调节肠道乳糖酶活性，表明其在解决胃肠道紊乱方面发挥着关键作用。此外，藿香正气散也在一定程度上影响了肠道细菌的代谢功能。细菌代谢的这种调节与观察到的肠道内消化酶活性的变化相对应，进一步强调了藿香正气散的治疗效果。

相关论文信息

论文原文刊载于CellPress细胞出版社

旗下期刊Heliyon上，

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▌论文标题：

Unlocking the therapeutic potential of Huoxiang Zhengqi San in cold and high humidity-induced diarrhea: Insights into intestinal microbiota modulation and digestive enzyme activity

▌论文作者：

Yi Wu, Na Deng, Jing Liu, Ying Cai, Xin Yi, Zhoujin Tan

▌论文网址：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2405844024088200

▌DOI：

https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2024.e32789

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