如何提升科研相机成像信噪比？从这6个因素出发来看看！
成像结果是一款科研相机是否优秀的直接评判标准。而一般来讲，我们会从3个重要特征来看：
· 黑白还是彩色
彩色相机能带来颜色信息，但灵敏度和分辨率都不及同参数的黑白相机。
· 帧速
无论是高速移动的样品还是一闪而过的光信号，都需要高帧速相机才有可能采集到。
· 成像质量
影响成像质量（或者经常听到“清晰度”这样的口头表述）的因素，包括信噪比和分辨率。无论是信噪比过低，还是分辨率过低，都无法得到让人满意的图片，如下图：
信噪比和分辨率对成像质量的影响
关于分辨率，在往期文章中有讨论过（跳转阅读），今天我们在这里则主要讨论影响着成像质量的另一个重要因素——信噪比。
从一个公式，来解析“信噪比”
首先，我们来看一下啥是“信噪比”。
在相机的成像过程中，除了真实的信号，还会引入一系列的不确定性（光信号本身的不确定性、材料热运动，电子学噪声等等）——称为噪声。而信号与噪声的比值被定义为“信噪比（Signal-to-Noise Ratio，SNR）”。
相机的信噪比可以通过如下公式计算得出：
公式中的分子部分就是“信号”。单位时间的入射光子数目（P，即信号的强度）乘以曝光时间（t），即为入射光子的总数目。其中有一定比例（QE，量子效率）被相机转换为电荷，最终成为相机成像的“信号”。
而公式中的分母部分则是“噪声”。看着分母上那一大串，大家估计也能感到到其组成部分应该挺复杂的。确实，组成“噪声”的有3个部分：
# 第一部分 #
来自“真实信号”的散粒噪声
如何理解这个“散粒噪声”呢？打个比方，原始的光信号对应每秒钟100个光子落到一个像素上，但实际的情况却有可能是第一个一秒钟落下了97个光子，第二个一秒钟落下了104个光子，第三个一秒钟落下来101个光子，等等等等。这种不确定性就是散粒噪声的来源。
# 第二个部分 #
来自“暗电流”的散粒噪声
由于相机的芯片是Si（或者InGaAs等其他材料），只要不是绝对零度，材料本身的热运动也有几率产生会被当作“信号”读出的电子——称之为暗电流。
暗电流可以随着时间而积累。虽然暗电流是可能通过后期算法给扣除的，但是其不确定性，或者说来自于暗电流的散粒噪声却无法消除。
# 第三个部分 #
读出噪声
读出噪声的来源很多，实际操作中，将相机的盖子关闭（即没有任何光信号），采用最短的曝光时间（尽可能排除暗电流/暗噪声的影响）所得到的图像中的像素值的不确定性，就被记为读出噪声。
读出噪声是一个笼统但是很有实用性的概念——尤其在高速弱光成像中，因为此时曝光时间很短，所以暗电流/暗噪声都很小，主要的噪声来源就是读出噪声。
由于以上三种噪声来源互不相关，所以，总噪声就等于其平方和再取平方根。
对于特定的拍摄条件，读出噪声和暗电流都是固定的。所以信号越强，其散粒噪声也越大，继而成为噪声的主要来源。此时信噪比公式可以近似为：
但是，在大部分的科研成像应用中，所需要捕捉的信号都比较微弱。信号一弱，来自信号的散粒噪声就很小，此时读出噪声和暗电流的影响就不能忽略了。
那么，如果希望提升成像的信噪比，改善信号较弱时的成像质量，在相机选型、使用中我们要注意哪些因素呢？
大致来说，可以从以下6个方面来综合考虑：
曝光时间
光学系统的素质
像素尺寸
制冷与暗电流
量子效率
读出噪声（R）
# 影响信噪比的因素（1）——曝光时间 无论是从大家日常的理解还是从信噪比公式中，我们都很容易得出曝光时间（t）越长，信噪比越高的结论。 |
图4. 曝光时间与信噪比的关系 |
然而，曝光时间长了，帧速就无法得到保障。曝光时间为1s的时候，无论如何帧速也是无法超过1帧/秒的。 小结：曝光时间的延长能够提升信噪比，但是会损失帧速。 |
# 影响信噪比的因素（2）——光学系统的素质 对于同一样品发出的信号，光学系统直接影响到落到相机上的光信号强度（即公式中的"P"）。对于显微成像而言，最常见的的提升方式就是选择更好的物镜；一般而言，数值孔径（NA）越大，物镜对信号的收集能力越强。 |
图5. 不同数值孔径（NA）的物镜对成像效果的影响。(a) Plan 20×/0.4 NA; (b) UPlanFL N 20×/0.5 NA; (c) UPlanSApo 20×/0.75 NA.（参考用图，如若侵权请联系删除） |
小结：用你能得到的最好的光学系统 |
# 影响信噪比的因素（3）——像素尺寸 像素尺寸也是影响信噪比公式中的"P"（入射的光子数目）；像素尺寸越大，落到一个像素上的光子就越多。在其他参数都一致的情况下，信噪比自然就越高。但过大的像素尺寸会损失相机的分辨率。 小结：在不调节光路仅仅更换相机的情况下（这是非常常见的场景），采用更大像素尺寸的相机在增加信噪比的同时往往会降低图像的分辨率（如图6）。 |
图6. 不同像素尺寸相机对同一样品的成像效果对比。样品为直径1μm的荧光小球，放大倍数60X |
# 影响信噪比的因素（4）——制冷与暗电流 由于暗电流（信噪比公式中的"D"）来源于材料中电子的热运动，所以芯片温度越高，暗电流越大；对于同一芯片，近似的规律是温度每下降10度，暗电流减小一半。 当前市场上的中高端科研相机的暗电流通常都很小，在1s以下曝光时间时，暗噪声相比于读出噪声通常可以忽略。但由于暗电流随曝光时间会积累，所以越是长曝光时间的应用，制冷就越重要。 在实际选型中，不同类型的相机对制冷的要求也不尽相同： （1）对于EMCCD相机，像素尺寸通常较大（常见的为13-16μm），每个像素上产生的暗电流本就较多，而且EMCCD中的暗电流还会和信号一起被增益放大，所以用制冷压制EMCCD相机的暗电流产生尤其重要。因为这些原因，主流的EMCCD相机制冷温度都在-50℃以下。 （2）而对于sCMOS相机，不仅像素尺寸会较小一些（常见的为6.5μm），也没有额外的增益，所以对制冷的要求就相对低一点。 从图7中可以看到，在sCMOS相机中，制冷温度的具体高低影响不是那么明显，但有没有制冷对暗噪声的表现影响很大（图7-A是没有制冷的相机，图7-B,C,D都是有制冷的）。这是因为，一旦没有制冷，相机的芯片工作温度并不是简单的室温，而通常高达60-70℃，在长时间曝光中（如图7中的10s曝光时间），其暗电流自然就会高到不可忽视。 笔者在平时工作中，就曾经有过两个有趣的相关经历。第一个是刚接触科研相机时，看到许多诸如室温下10℃（-10℃ from ambient temperature）的相机，表示不可理解，觉得"就10度的制冷，这有啥用？"。第二个是滨松有一款面向产业客户的板级sCMOS相机C11440-62U，其制冷温度为室温上10℃（+10℃ from ambient temperature），刚看到参数的时候也是小小疑惑了一把。其实当年产生这样的疑惑，就是因为没有意识到如果相机没有制冷，实际的工作温度将远超室温这一点。 |
图7. 冷却对相机的影响。四张图片来自于四台相机，均采用10s的曝光时间，LUT设置成一样。这四台相机采用了同样的芯片，但制冷温度不同。从左至右依次为：(a) 没有制冷（C11440-52U）；(b) 制冷温度为10℃（C11440-42U）；(c) 制冷温度为-10℃（C11440-22CU，风冷模式）；(d) 制冷温度为-20℃（C11440-22CU，水冷模式） |
小结：对于当今的高端相机，只要有制冷，暗电流都很小。 |
# 影响信噪比的因素（5）——量子效率 量子效率（即信噪比中的QE）为光子在相机像素上转换成为电子的比例。同样是100个光子落到一个像素上，QE 82%意味着相机能够转换得到82个电子；QE 72%则代表能转换得到72个电子。显然，QE越高，相机的信噪比越高。 |
图8. 量子效率对信噪比的影响 |
有关QE，看参数时需要特别注意以下两点： （1）QE与波长是有关的，对于同一台相机，不同波长的QE并不相同。以ORCA-Flash 4.0 V3为例，在600nm的红光处其QE为最高的82%，在900nm的红外光处就只剩下了25%左右。 （2）一般我们在高端科研相机的参数表中看到的都是量子效率峰值——也就是相机最灵敏的波长所对应的QE。但是，不同相机/芯片的量子效率峰值所对应的波长并不一样，所以如果确切的直到自己信号的波长/颜色，最好能够确认下相机在对应波长下的QE，而不是简单地比较量子效率峰值。 如图9中左图所示，ORCA-Spark的峰值波长在450-500nm之间，QE峰值为80%；而Flash 4.0 LT的峰值波长在550-600nm之间，QE峰值为72%。虽然ORCA-Spark的量子效率峰值更高，但如果针对红色荧光，Flash 4.0 LT的QE反而更好。 小结：QE很重要，但QE峰值更多是个参考，查到关注波长的QE值非常关键。 |
# 影响信噪比的因素（6）——读出噪声（R） 在信号较弱的成像中，来自信号的散粒噪声较小；而暗电流的散粒噪声（即暗噪声）在当前的高端科研相机都是很低的，在曝光时间1s这个量级甚至更短的时候，暗噪声通常可以忽略；此时读出噪声（即信噪比公式中的"R"）就称为特别需要考量的因素了。 对于同样的芯片，读出噪声的大小与读出速度有关，无论对于CCD相机还是sCMOS相机，读出速度越快，读出噪声越高。而sCMOS相对于CCD的一个核心优势，就是高速读出时依然能够保持极低的读出噪声。 读出噪声的重要性也使得其和QE一起变成了相机被重点关注的两个参数。单纯考察两者中的一个优势并不能正确预测成像的信噪比。如图9所示，同样拍一个绿色荧光样品，QE较高的ORCA-Spark成像质量却不如ORCA-Flash 4.0 LT，就是因为ORCA-Flash 4.0 LT的读出噪声较低，综合考虑时ORCA-Flash 4.0 LT的信噪比更好。 |
图9. 读出噪声对信噪比的影响 |
小结：如果用于弱信号探测，相机的读出噪声对于总体的信噪比很重要。 |
往期回顾
这是中国光学发布的第1092篇，如果你觉得有意思，转发到朋友圈也能让我们对自己的努力感到值得。