单细胞测序揭示椎间盘退行性变中独特软骨细胞亚群及发病机制

近日，青岛大学附属医院脊柱外科马学晓教授团队采用新格元单细胞测序技术，在《Osteoarthritis and Cartilage》上发表关于椎间盘退变单细胞测序文章，题为：Single-cell RNA-seq analysis identifies unique chondrocyte subsets and reveals involvement of ferroptosis in human intervertebral disc degeneration。文章采用6例人髓核组织，利用新格元海量单细胞转录组测序技术，获得高质量的单细胞测序数据，进行生信分析获得新发现，对椎间盘退变的发病机制有新的指导意义。

研究背景

椎间盘退行性变(IVDD)被认为是腰痛的重要原因。椎间盘由纤维环(AF)、髓核(NP)和软骨终板三个部分组成。髓核细胞(NPCs)作为NP中主要细胞类型，负责II型胶原蛋白和蛋白聚糖的合成，这两种成分含量降低是IVDD主要特征。NP在椎间盘退变的发病机制中起着核心作用，但NP中的细胞亚群及其在椎间盘退变中相应的生物学过程尚未见报道。目前已有Bulk RNA 测序(RNA-seq)或微阵列芯片(Microarray)描述NP在IVDD过程中的生物学差异，但不能反映单个细胞亚群类型和功能。单细胞RNA测序(scRNA-seq)可同时分析10000多个单细胞并研究转录组细胞间变异，识别各种细胞类型，洞察生理、病理过程。

方法流程

研究结果

// scRNA-Seq揭示NP中的不同细胞类型

测序得到30300个细胞，分为3个不同的细胞簇。簇1(~99.33%)由软骨细胞组成，表达 ACAN，COL2A1，SOX9，FMOD和COMP。簇2(~0.57%)为表达LYZ，CD14，IL1B，TNF和MRC1的巨噬细胞。簇3(~0.10%)为表达CDH5，PECAM1和CLDN5的内皮细胞。scRNA-seq结果显示，内皮细胞仅存在于IVDD样本中，并随疾病严重程度而增加。此外，所有来自IVDD的NP样本中都有巨噬细胞，正常椎间盘缺乏免疫细胞，如巨噬细胞或中性粒细胞，但无论是动物实验或临床观察，椎间盘退变都伴随巨噬细胞浸润。 

NP中的不同细胞类型

// scRNA-seq鉴定7个软骨细胞亚群

 基于软骨细胞作为主要类型，在NP的正常功能中起着重要的作用，作者对簇1软骨细胞做了进一步的研究。鉴定了3个已经确定的细胞群和4个新的细胞群：

1. 纤维软骨细胞祖细胞（FCPs），表达MYLK和COL3A1；

2. 软骨祖细胞（CPCs），表达 BIRC5，CDK1，CENPU，DHFR和STMN1；

3. 稳态软骨细胞（HomCs），表达JUN，BRD2，RGS2和CCNL1；

4. C1，高表达MGP，FGF2和CD55；

5. C2，高表达PRG4，COL2A1，MSMO1，VCAN和SCRG1；

6. C3，高表达CXCL1，MMP13，COL12A1，AEBP1，TNC和CD44；

7. C4，高表达COL1A1，COL3A1，LGALS1和MMP14。scRNA-seq 揭示了具有不同标记的7个软骨细胞亚型。

7个软骨细胞亚群

// GO和KEGG分析软骨细胞亚群通路

 作者为研究7个软骨细胞亚群中差异表达基因的潜在功能，进行了GO和KEGG分析。结果显示，C1与细胞因子活性有关，可能参与血管生成；C2与细胞外基质结构成分有关，在机体机械转导中起重要作用；C3和C4显示相似功能，如胶原蛋白结合、细胞粘附分子结合和整联蛋白结合；CPCs具有自我更新的能力，能沿多种谱系分化，表达干细胞相关的表面标志物。在本研究中，GO分析显示CPCs具有染色体分离、核分裂和暗示细胞周期活性的能力。FCPs具有多向分化潜能，能稳态维持纤维软骨细胞发育，本研究中GO分析显示FCP中的分子功能与蛋白质加工有关，HomCs可能在蛋白质代谢中起重要作用。KEGG分析显示与对照或重度 IVDD组相比，轻度 IVDD组(FTL、HMOX、CP)中与铁死亡相关的基因显著富集。与 NC相比，IVDD组的 C2、C4、CPC和HomCs中铁死亡信号上调，这些结果表明铁死亡参与了椎间盘退变的发病机制。

GO和KEGG分析软骨细胞亚群通路

// Pseudotime和Cellphone DB分析单细胞分化轨迹和细胞间的通讯

CPCs主要集中在轨迹的根部，FCPs出现在中后期。对整个细胞群中的细胞通讯进行Cellphone DB分析，发现C2与C4之间有140多个相互作用。C2、C4和HomC与M2巨噬细胞的相互作用相似。此外，C2还通过近100个相互作用与C3连接。数据结果表明，C2可能在NP的微环境中起着重要作用，负责参与多个细胞亚群间的通讯。C1亚群与巨噬细胞(M1，M2)的细胞通讯比C2、C3和C4亚群多。C4亚群与内皮细胞的相互作用明显多于其它亚群。综上所述，不同的细胞亚群可能在炎症和血管生成中起着微妙的作用。

单细胞分化轨迹和细胞间的通讯

// 铁死亡参与IVDD发病机制

作者用双足大鼠建立了IVDD 模型以验证scRNA-seq 结果，结果显示软骨终板与纤维环之间的间隙缩短，IVDD大鼠的NP区域的细胞数量减少，红色区域减少和绿色区域增加表明IVDD大鼠的蛋白聚糖含量减少，进一步证实了大鼠模型中椎间盘的退化。对铁含量进行测定发现IVDD大鼠NP组织中的铁含量显著增加，表明铁在IVDD的NP组织中积累，这是铁死亡的标志。评估铁蛋白轻链(FTL)和血红素加氧酶1(HO-1)在椎间盘组织中的水平，IVDD样本NP组织中FTL表达下调，HO-1表达上调。综上所述，这些结果表明铁死亡参与了IVDD的发病机制。

铁死亡参与IVDD发病机制

研究结论

本研究通过scRNA-seq对NC、轻度IVDD和重度IVDD患者的NP进行研究，确定了3种细胞类型(软骨细胞、巨噬细胞、内皮细胞)，以及7个软骨细胞亚群，其中4个亚群(C1-C4)是首次报道。通过GO和KEGG分析发现，铁死亡的途径丰富。建立椎间盘退变大鼠模型，发现模型组NP铁含量显著高于对照组， HO-1水平也升高。与对照组相比，模型组的FTL水平显著降低，表明铁死亡参与了IVDD的发病机制。本研究为IVDD发病过程中的病理变化提供了新的见解，可能成为干预IVDD的新靶点。

参考文献

Zhang, Han, et al. “Single-cell RNA-seq analysis identifies unique chondrocyte subsets and reveals involvement of ferroptosis in human intervertebral disc degeneration.” Osteoarthritis and Cartilage.2021. July.

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