人类哺乳期间乳汁中乳腺细胞的转录变化
研究背景
乳腺在女性的整个生殖周期中经历组织重塑的循环，尤其是在怀孕、哺乳和恢复静止状态的过程中。成年乳腺最显著的扩张和分化发生在怀孕和哺乳期间对系统生殖激素的反应，以使乳汁合成和分泌能够维持后代。乳腺由双层导管细胞和内层管腔细胞（Luminal cells，LCs）组成，在哺乳过程中分化为管腔上皮细胞和基底上皮细胞（Myoepithelial cells，MY）。在乳腺中，导管细胞嵌入到富含胶原蛋白基质、间充质细胞以及免疫细胞中，这些结构与细胞的变化是合成和分泌乳汁所必需的。在小鼠模型中发现，这些变化在表观遗传水平上对乳腺上皮有着显著的影响，并产生与胎次相关的细胞类型。乳腺中发生的这些分子和细胞变化也许能够解释增加胎次和延长哺乳期从而降低乳腺癌风险的机制。此外，最近的研究已经开始使用单细胞转录组对人类乳腺亚群进行研究。然而，由于获取样本的难度较大，发生在怀孕和哺乳期间的人类乳腺组织重构过程仍然知之甚少。
方法流程
从9个母乳样本和7个非哺乳期乳腺组织中分离得到110744个活乳腺细胞，包括56030个哺乳来源的乳腺细胞(Lactation-derived mammary cells, LMCs)和54714个非哺乳来源的乳腺细胞(Non-lactation-derived mammary cells, NMCs)，通过单细胞测序分析泌乳乳腺上皮细胞簇、哺乳期基质细胞和免疫细胞以及乳源性管腔簇和非泌乳管腔祖细胞之间的差异，从而了解人类哺乳期间细胞变化，为进一步深入了解怀孕、哺乳和乳腺癌之间的相互作用奠定基础（图1）。
图1 实验流程示意图
结果
1、哺乳期与非哺乳期乳腺细胞的多样性
将乳房组织和人乳分离得到的NMCs单细胞和LMCs单细胞在二维培养板或三维浮动胶原凝胶中培养，可以产生单层培养物或乳腺类器官（图2a）。使用流式细胞术分析NMCs和LMCs的不同乳腺亚群，结果发现NMCs由CD45-/EpCAM-/CD49f+基底上皮细胞、CD45-/EpCAM+/CD49f+管腔祖细胞（luminal progenitor，LP）和CD45-/EpCAM+/CD49f-成熟管腔细胞组成（图2b），这些亚群在LMCs中无明显差别，因此，流式细胞术分析不足以表征LMCs中存在的亚群。
研究者使用单细胞转录组测序（scRNA-seq）来确定不同成熟状态的细胞之间的表型差异。LMCs和NMCs之间由于它们的来源不同发生分离，从而使研究者能够探索泌乳和非泌乳人体乳腺之间的转录差异。通过单细胞测序结果注释得到上皮细胞簇、基质细胞簇和免疫细胞簇（图2c）。
图2 NMCs和LMCs之间的多样性
2、乳腺上皮细胞簇揭示不同发育阶段的亚群
通过聚类分析乳腺上皮细胞亚群，共有5个主要上皮细胞簇，即LC1、LC2、MY、LP、HR mature LCs（hormone-responsive mature LCs，成熟管腔细胞）（图3a）。对于NMCs样本主要有3个细胞簇（MY、LP、HR mature LCs），MY主要表达ACTA2、MME、TP63；LP与HR共表达关键管腔marker（KRT18和EPCAM），其中HR mature LCs表达编码雌激素、孕酮和催乳素激素受体的基因（ESR1、PGR、PRLR）；LP表达转录因子ELF3、ALDH1A3、SLPI；对于LMCs样本主要有2个细胞簇（LC1、LC2）。LC1和LC2共同表达关键管腔marker（KRT18和EPCAM）和人乳蛋白基因（LALBA、CSN2、CSN318）（图3b）。
为更好理解LMCs中分泌管腔细胞的异质性，通过比较LC1与LC2的差异基因，发现1640个基因在LC1中高表达，1782个基因在LC2中高表达（图3c）。为了了解LCs调节基因表达调控的差异，对NMCs和LMCs的所有亚群进行了单细胞调控网络和聚类分析。结果发现LC2的前10个调节基因在LC1中也高度表达，如STAT5A（图3d，e），并且转录因子STAT5A已被证实是分泌性LCs分化和泌乳的必要条件；而调节基因SOX10在LC1中具有异质性（图3e），且SOX10在祖细胞中高表达，是乳腺发育的重要调节因子。虽然LCs具有共同的高表达基因，但它们很可能受到具有不同下游效应的转录因子的调节。因此，母乳中含有两种不同的分泌细胞群，它们都高度表达哺乳相关基因并且差异调节每种细胞类型的基因表达谱特征。
图3 NMCs和LMCs乳腺上皮细胞的亚群聚类分析
3、基质细胞和免疫细胞的异质性
ScRNA-seq分析确定了免疫细胞和基质细胞的5个亚型，即免疫细胞（Immune cells，IM）、血管辅助细胞（Vascular accessory cells，VA）、内皮细胞（Endothelial cells，EN）、成纤维细胞（Fibroblasts，FB）。通过分析发现，LMCs样本中无VA、EN、FB谱系细胞，而LMCs和NMCs样本中都鉴定出PTPRC+的IM细胞（图4a）。
为了更好地确定IM细胞的不同亚型，IM细胞从NMCs和LMCs中聚类分析鉴定出12个由髓系或淋巴细胞组成的亚群（图4b，c）。通过CellChat分析IM细胞和LCs之间发生的潜在信号传导，在LC1/LC2和IM细胞亚型之间发现了许多潜在信号通路的受配体互作（图 4d）。其中LC1可能是通过表皮生长因子、中期因子（肝素生长因子家族的成员）和骨桥蛋白（SPP1）信号通路从IM细胞中接收信号从而发挥功能；LC1和LC2表达与主要组织相容性复合物I类和II类（MHC-I 和 MHC-II）、集落刺激因子（CSF）和颗粒蛋白信号传导（GRN）途径相关（图4d）。因此，与上皮细胞不同，LMCs与NMCs中的IM相似，表明在上皮细胞中观察到的转录差异反映了其真正的生物学特性。
图4 NMCs和LMCs基质细胞和免疫细胞异质性研究
4、LMC-LCs和NMC-LPs之间的差异
通过分析基因集在亚群中的表达水平得分可知LC1和LC2在LP中大量富集，表明LCs与LPs中NMCs具有相似的表达模式（图5a），即分泌型LCs有可能来自人类的LPs。使用差异基因表达分析将NMCs中LPs与LMCs分泌型LCs进行比较，结果发现1146个基因在LCs中显著上调，922个基因在LPs细胞中显著上调（图5b）。对前10%的基因（LPs为114个基因，LCs为92个基因）进行GO分析，发现NMC-LPs高表达的基因富集与上皮细胞状态、激素反应、细胞运输、炎症或细胞粘附的生物过程相关。LMC-LCs上调基因富集与脂肪酸代谢/储存、锌转运、分泌和免疫调节反应相关（图4c-d）。这些基因的鉴定可能参与乳腺正常功能，也可能用于乳腺癌异常分化的研究。综上所述，从母乳中提取的乳腺细胞有助于深入了解乳腺的功能，并为深入研究乳腺癌的发展提供思路。
图5 比较LMC-LCs与NMC-LPs的差异
结论
1、通过单细胞测序首次比较了人类乳汁和非哺乳组织中分离的乳腺细胞组成差异；
2、LMCs中发现了两个分泌型LCs（LC1和LC2），LCs与LPs中NMCs具有相似的表达模式；
3、NMCs和LMCs中共同鉴定到IM细胞，而LMCs样本中没有VA、EN、FB谱系细胞；
4、LMC-LCs和NMC-LPs差异基因分析为哺乳困难人群提供治疗靶点，并为乳腺疾病的治疗提供新思路。
参考文献
[1] Twigger AJ, Engelbrecht L.K, Bach K. et al. Transcriptional changes in the mammary gland during lactation revealed by single cell sequencing of cells from human milk. Nat Commun 13, 562 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-021-27895-0.