《中国农业科学》柑橘研究合辑 （2018-2019）

本合辑集选《中国农业科学》 2018—2019年发表的有关柑橘研究的相关论文，希望对领域内科研人员有所帮助。欢迎查看、收藏、引用。识别二维码可阅读PDF全文。

重庆三峡库区鲍威尔脐橙花期叶片矿质营养诊断

■郑永强，王娅，杨琼，贾学梅，何绍兰，邓烈，谢让金，易时来，吕强，马岩岩

【目的】通过对重庆三峡库区江津和奉节鲍威尔脐橙果园叶片矿质元素测定并进行叶片营养状况诊断，为鲍威尔脐橙高产优质施肥方案的制定提供依据。【方法】以重庆三峡库区江津和奉节40个代表性12年生枳橙砧鲍威尔脐橙小区植株为试材，通过测定盛花期叶片中氮（N）、磷（P）、钾（K）、钙（Ca）、镁（Mg）、铁（Fe）、铜（Cu）、锰（Mn）、锌（Zn）元素的含量和小区产量，运用叶片营养组分分析法(CND)、诊断施肥综合法(DRIS)和标准含量适宜偏差百分数法(DOP)3种方法对两个地区低产组叶片营养状况进行诊断。【结果】根据CND拐点法确定高产园划分临界值为330 t·hm^-2，其中仅有奉节地区6个小区满足此条件，占总样本15.0%，同时依据高产组叶片N、P、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu和Zn等各营养元素含量范围确定上述元素适宜值分别为N(2.0±0.1)%、P(0.12±0.01)%、K(2.1±0.5)%、Ca(3.1±0.4)g·kg^-1 DW、Mg (0.31±0.03)g·kg^-1 DW、Fe(36.6±13.1)mg·kg^-1 DW、Mn (51.4±21.6)mg·kg^-1 DW、Cu(2.2±0.7)mg·kg^-1 DW和Zn(12.3±1.5)mg·kg^-1 DW；建立不同营养元素CND法叶标准参比值为V_N*=3.62±0.07，V_P*=0.78±0.08，V_K*=1.36±0.21，V_Ca*=1.74±0.14，V_Mg*=-0.55±0.10，V_Fe*=-2.74±0.36，V_Mn*=-2.40±0.39，V_Cu*=-5.55±0.32，V_Zn*=-3.78±0.10；依据DRIS法对江津地区筛选出N/K、N/Fe、N/Cu、P/K、P/Fe、P/Cu、K/Fe、K/Cu、Ca/N、Ca/P、Ca/K、Ca/Fe、Ca/Mn、Ca/Cu、Mg/N、Mg/P、Mg/K、Mg/Fe、Mg/Cu、Mn/N、Mn/P、Mn/K、Mn/Mg、Mn/Fe、Mn/Cu、Mn/Zn、Zn/Ca、Zn/Mg、Zn/Fe、Zn/Cu等30个，奉节地区筛选出Ca/K、Mg/K、Mg/Zn、Mn/N、Mn/P、Mn/K、Mn/Ca、Mn/Mg、Mn/Fe、Mn/Cu、Cu/P、Cu/K、Cu/Mg、Cu/Fe等14个叶片营养浓度比值参数；根据叶片矿质元素含量适宜值采用CND、DRIS、DOP 3种方法对奉节低产小区和江津地区橘园盛花期叶片营养诊断。其中，CND法需肥顺序：江津为Ca＞Mg＞N＞P＞Mn，奉节为N＞Ca＞P＞Zn＞Fe＞Mn；DRIS法需肥顺序：江津为Ca＞Mg＞＞Mn＞N＞P，奉节为Zn＞＞Fe＞Ca＞Mn＞N＞Mg；DOP法需肥顺序，江津为Ca＞Mn＞Mg，奉节为Mn＞＞Zn＞Fe＞Ca＞Mg＞N。【结论】3种方法诊断结果表明，果园营养不平衡指数江津地区CND、DRIS、DOP分别为166.5、4 291.0、117.5，奉节低产小区分别为37.2、570.0、14.1，奉节果园营养平衡状况均优于江津，两产区均具有很大的增产潜力。

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柑橘品种鉴定的SSR标记开发和指纹图谱库构建

■李益，马先锋，唐浩，李娜，江东，龙桂友，李大志，牛英，韩瑞玺，邓子牛 

【目的】筛选出一套SSR核心引物，用于构建柑橘品种的DNA指纹图谱库，为柑橘种苗认证、品种登记和植物新品种保护提供技术支撑。【方法】以柑橘属8个主要栽培种类为试材进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出多态性丰富、扩增条带稳定的引物对部分参试品种进行PCR扩增，扩增产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行进一步的引物筛选；筛选得到的引物进行荧光标记，并选用部分柑橘品种进行PCR扩增，扩增产物利用基因分析仪检测，分别计算各引物的PIC值、等位基因数目，选取一套多态性丰富的适合进行荧光毛细管电泳检测的SSR引物组合，进而对所有参试品种进行分析，构建柑橘品种的DNA指纹图谱库，同时利用筛选的SSR标记对参试品种进行鉴定。【结果】初期以柑橘属8个种的代表品种（太田椪柑、沙田柚、沅江酸橙、大红甜橙、邓肯葡萄柚、枸橼、费米耐劳柠檬和墨西哥来檬）为材料，用362对SSR引物进行PCR扩增，扩增产物经4%琼脂糖凝胶电泳检测，初步筛选出80对种间多态性高、扩增稳定的SSR引物；进一步从8个种类里选择不同类型的64个柑橘品种，用上述筛选出的80对SSR引物进行PCR扩增，扩增产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，再筛选出60对品种类型间多态性高、扩增稳定、条带清晰的SSR引物，并分别进行荧光标记；另以168份柑橘品种为材料对上述60对SSR引物进行PCR扩增，经荧光毛细管电泳检测，依据各引物的PIC值、等位基因数目、峰图读取难易程度、扩增稳定性及染色体位置等，最终筛选出21对SSR引物作为指纹图谱库构建的核心引物。为消除不同仪器、不同试验批次等引起的误差，为21对SSR引物各主要等位变异选择相应的参照品种。根据各引物标记的荧光颜色及扩增片段大小进行合理组合，21对SSR引物可分成5组进行多重电泳，共采集500份柑橘品种的DNA指纹。利用SSR标记，有111份品种仅用1对引物即可鉴别，86份品种用2对引物组合即可鉴别，24份品种用3对引物组合即可鉴别，另外279份品种虽无法单独一一鉴别，但可分为87个小组，组内品种无法区分，组间品种易鉴别。【结论】利用筛选出的21对SSR核心引物，构建了包含500份柑橘品种的DNA指纹图谱库，筛选出部分品种的特异标记，可以鉴别221份柑橘品种和87个品种组合，构建了基于毛细管电泳平台的柑橘SSR分子标记品种鉴定体系。

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柑橘CitCEP基因家族的鉴定及对逆境和激素的响应

■潘小婷，张静，葛廷，马岩岩，邓烈，何绍兰，易时来，郑永强，吕强，谢让金

【目的】基于全基因组鉴定分析柑橘CEP基因（CitCEPs）家族成员，了解各成员的分类进化关系，研究各基因成员在不同组织中的表达特异性以及对激素和非生物胁迫的响应，为进一步研究CEP基因家族的生物学功能打下基础。【方法】利用BLASTp基于Phytozome数据库鉴定柑橘CEP家族成员，采用GSDS、ProtScale Tool、EXPASY、CLUSTALX、MEGA6.0、plantCARE、Cello等软件绘制家族成员基因结构图；分析预测蛋白的相对分子质量与等电点等理化性质；构建系统进化树及亚细胞定位预测等，利用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）检测柑橘CEP基因家族各成员在‘资阳香橙’(‘Citrus junos Ziyang’)不同处理下的瞬时表达情况。【结果】柑橘CEP基因家族由11个成员组成，其中CitCEP10和CitCEP11含1个内含子，其余成员均无内含子；该基因家族成员均含有SPGV/IGH保守结构域序列，其预测蛋白均为亲水性蛋白，亲水性最强的氨基酸其值为3.711，亲水性最弱的氨基酸其值为-2.778；亚细胞定位预测结果显示该基因家族成员位于细胞不同位置，其中CitCEP1、CitCEP2、CitCEP4、CitCEP5、CitCEP6、CitCEP8定位于细胞外，CitCEP3和CitCEP7在细胞外和线粒体中均存在，CitCEP9位于细胞核中，CitCEP10在细胞质膜上，而CitCEP11位于线粒体和细胞核中；聚类分析发现，该家族成员分布于不同的分支中，分别与拟南芥CEP不同成员聚在一起，表明柑橘CEP成员间具有不同生物功能。表达分析显示，CitCEP2主要在茎、叶和子叶中表达，CitCEP3主要在根和子叶中表达，而CitCEP10和CitCEP11主要在果皮中表达，其余成员在上述组织中表达极低或不表达，体现了不同成员间组织特异性的差异。在干旱条件下，CitCEP2表达下调，CitCEP3、CitCEP10和CitCEP11的相对表达量均逐渐上调；而在盐胁迫下，CitCEP2、CitCEP10的响应模式与其所对应的干旱胁迫类似，CitCEP3和CitCEP11则呈现先升后降趋势。在乙烯（ETH）、脱落酸（ABA）处理下，CitCEP2的表达量明显受到抑制，而在茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）、生长素（IAA）、赤霉素（GA₃）处理下均表现为先上升、后下降的趋势；在6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、IAA、GA₃、ABA处理下CitCEP3也表现出类似趋势。CitCEP10在ETH处理下表达量显著上升，在6-BA、SA、ABA处理下表达量呈现先下降后上升趋势，而在MeJA、IAA、GA₃处理中无明显规律。CitCEP11在ETH、MeJA、SA、IAA、GA₃、ABA处理下表达均呈现下调趋势，与CitCEP3在ETH、SA处理下的表达模式类似。在6-BA处理下，CitCEP11表达呈现先下降后上升趋势。【结论】从柑橘全基因组上鉴定出了11个CitCEP基因成员，各成员均为亲水蛋白，并含有SPGV/IGH保守结构域，位于细胞中不同位置。在不同逆境和激素处理下，CitCEP2、CitCEP3、CitCEP10和CitCEP11呈现不同程度的响应，而其余成员响应不明显或未响应。推测CitCEP2、CitCEP3、CitCEP10与CitCEP11在柑橘生长发育和逆境响应过程中可能起着重要作用。

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枳NLP转录因子响应干旱胁迫并与NRE顺式作用元件互作

■曹雄军，卢晓鹏，熊江，李静，谢深喜

【目的】探讨枳氮素含量在干旱条件下的变化，以及氮代谢途径枳亚硝酸还原酶基因（NiR）和NLP转录因子的响应表达，分析确定枳NLP转录因子与NiR启动子区域硝酸盐响应顺式作用元件（nitrate-responsive cis-element，NRE）位点绑定互作。【方法】以一年生的砧木枳为试验材料，进行干旱处理直至植株叶片开始萎蔫，并设置对照。利用凯氏定氮仪检测干旱条件下枳叶片和侧根的全氮含量，并同步利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和2^-ΔΔCT法分析PtNiR、PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8在枳叶片和侧根的表达情况。通过基因克隆并检索与比对分析，获取PtNiR启动子区域的硝酸盐响应顺式作用元件序列，之后利用同源克隆方法构建用于酵母单杂交的pHIS2-4×NRE和pGADT7-Rec-NLP载体，将构建的pHIS2-4×NRE和pGADT7-Rec-NLP载体质粒共同转化到酵母菌株Y187中，在氨基酸缺失培养基（SD/-Trp/-Leu，以及SD/-His/-Trp/-Leu/+120 mmol·L^-1 3-氨基三唑）上30℃恒温培养3—5 d，观察酵母的生长情况，以确定枳NLP转录因子（PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8）与NRE的互作关系。【结果】受干旱的影响，枳叶片全氮含量表现出先升高再下降的趋势，而侧根中全氮含量则显著下降；在对照中，枳叶片和侧根全氮含量均显著上升。RT-qPCR分析表明，PtNiR的表达水平在叶片中先上调然后再显著下调，而在侧根中则随着干旱程度的增加显著下调；ptNLP2、ptNLP4及ptNLP7在枳叶片和侧根中的表达也均呈现不同程度的先上调然后再受到抑制的规律，而ptNLP8在枳叶片和侧根中的表达则在一定程度上受到干旱抑制。通过克隆测序分析，在枳NiR启动子区域-196至-154的位置发现了疑似NRE。酵母单杂交分析表明，转化pHIS2-4×NRE-HIS3载体和pGADT7-Rec-NLP载体的Y187酵母在对照培养基（-Trp/-Leu）和含有120 mmol·L^-1 3-氨基三唑的三缺培养基（-His/-Trp/-Leu）上均能正常生长。【结论】枳侧根中的全氮含量受干旱的影响而显著下降，以对照为参比，枳侧根和叶片中的全氮含量均随着干旱时间的延长而相对减少。氮代谢途径的枳NiR和NLP转录因子在叶片和侧根中的表达对干旱有不同程度的响应。PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8转录因子均能与PtNiR启动子中的硝酸盐响应顺式作用元件（NRE）位点绑定互作，从而激活下游基因的表达。

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基于掩模及亮度校正算法的脐橙表面缺陷分割

■张明，李鹏，邓烈，何绍兰，易时来，郑永强，谢让金，马岩岩，吕强

【目的】本研究旨在有效解决果皮有缺陷的水果图像在去除背景时部分缺陷被误分割为背景，以及水果表面缺陷难以有效分割提取的问题。【方法】以I分量图来构建掩模模板，根据其灰度直方图信息，通过双峰法选择单一阈值（T=75）分以纽荷尔脐橙为研究对象，提出基于HSI颜色空间模型法去除背景割背景并填充孔洞得到掩模模板I_mask，然后掩模模板I_mask与I分量图通过点乘运算得到去除背景的I分量图；提出基于多尺度高斯函数图像亮度校正算法对去除背景后的I分量图像进行亮度校正，通过构建多尺度高斯函数滤波器，将去除背景后的I分量图与构建的多尺度高斯函数进行卷积运算即得到去除背景后的I分量图像表面光照分量图，最后将去除背景后的I分量图与得到的光照分量图进行点除运算即得到去除背景后的I分量图像亮度校正图；然后采用单一全局阈值法对脐橙表面缺陷进行提取。【结果】基于HSI颜色空间模型法去除背景，可在有效去除背景的同时完好保留脐橙的表面信息，有利于后续操作；基于多尺度高斯函数的图像亮度校正算法分别对6种常见脐橙缺陷进行图像亮度校正后采用单阈值法提取缺陷，使不同灰度等级的脐橙表面缺陷一次性分割成功，其中分割率最高为100%，最低为88.5%，整体达92.7%。通过试验分析后发现造成部分误分割或漏分割的原因主要在于部分缺陷果缺陷处颜色较轻，与正常区域灰度差较小，从而造成漏分割；还有部分缺陷果由于缺陷面积小，在图像形态学处理过程被误认为是噪声而被去除；同时发现正常果的误判率也达到了10.8%，经分析发现误判的正常果表皮组织区域的褶皱位于图像的边缘区域，从而被误认为是边缘区域的缺陷，导致误判。【结论】基于HSI颜色空间模型法去除背景及基于多尺度高斯函数的图像亮度不均校正算法对纽荷尔脐橙图像背景分割和去除背景后的I分量图像表面亮度校正均取得了较好的效果，能有效识别脐橙缺陷区域，为脐橙精确分级提供了技术支持，也为其他果品表面缺陷快速检测提供了一种新思路。

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三峡重庆库区施氮水平对塔罗科血橙树体养分、产量品质及土壤理化性质的影响

■杨江波，张绩，李俊杰，郑永强，吕强，谢让金，马岩岩，邓烈，何绍兰，易时来

【目的】通过在三峡重庆库区典型代表性柑橘园研究不同施氮水平对晚熟柑橘塔罗科血橙树体养分吸收、果实产量品质及土壤理化性质的影响，为三峡重庆库区晚熟柑橘优质丰产提供理论依据。【方法】以7年生枳橙砧塔罗科血橙为试材，研究在0（N0）、1（N1）、1.5（N2）、2（N3）、2.5（N4）和3 kg/株（N5）6个施氮水平处理下树体枝梢干物质积累量、枝叶与果实养分吸收、果实产量和品质以及土壤理化性质的差异。【结果】本试验结果表明，不同施氮水平处理后，血橙各时期叶片和枝条干物质量变化趋势相似，均表现为随着施氮量的增加显著增加，但春梢叶片干物质量在N3—N5处理差异不显著。不同时期的枝叶干物质量均表现为春梢大于秋梢，叶片干物质量要远大于枝条。春梢的氮、磷、钾养分吸收量在N0处理下均为最低，随着氮肥施入，吸收量显著增加，其中叶片的氮吸收量在N2处理达到峰值，磷、钾吸收量在N3处理达到峰值，随后有所下降，但差异不显著，枝条的养分吸收量一直在增加，N3—N5处理差异不显著。秋梢叶片和枝条的氮吸收量随着施氮量增加显著增加，在N5处理达到最大值，磷和钾吸收量在N0处理时略高于低氮处理（N1、N2），而高氮（N3—N5）处理显著增加。果实氮和钾含量随施氮量增加呈先增后降趋势，在N2处理达到最大值，各处理的果实磷含量差异不显著。果肉中氮和钾含量远高于果皮，而果皮中的磷含量高于果肉。不同施氮处理的果实养分带走量差异显著，随着施氮量的增加，果实氮、磷、钾养分带走量以N2处理最高，显著高于其他各处理；果实养分带走量顺序为钾＞氮＞磷。随着氮肥投入增加，土壤有机质含量显著下降，碱解氮和有效磷含量显著增加，速效钾含量在N3处理达到最大值后开始降低。土壤硝态氮淋溶作用随着施氮量增加而增大，0—20 cm土层内以N2处理硝态氮含量最高，显著高于N5处理；铵态氮含量比较稳定，与施氮量呈正相关；20—40 cm土层内各处理间的硝态氮、铵态氮含量差异均不显著；40—60 cm土层内高氮处理下硝态氮含量显著增加，而铵态氮含量变化不明显。果皮厚度与施氮量呈正相关，果实纵径、横径、单果重和产量均随着施氮量增加先增加后降低，N3处理纵、横径显著高于其他处理，而N2处理的单果重和产量最高。可溶性固形物含量随施氮量增加呈先增后降趋势，各处理间差异不显著；随施氮量的增加，可滴定酸含量增加，固酸比下降；维生素C和花色苷含量变化趋势相似，在N2处理达到最大值，随后显著降低。果实着色在N3处理下相对较好。相关性分析表明，叶片氮含量与果实可滴定酸含量和果皮厚度呈正相关，与固酸比呈负相关，土壤碱解氮含量与可滴定酸含量和果皮厚度呈极显著正相关，与固酸比呈极显著负相关。【结论】综合考虑，在三峡重庆库区柑橘园中，纯氮推荐用量为0.63—0.86 kg/plant，可保证果园较高的产量和果实品质水平，有利于血橙树体的养分吸收利用，同时果园土壤环境污染风险相对较小。

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柑橘U-box基因家族的鉴定及表达分析

■李秋月，张亚飞，彭洁，王旭，张志强，戴祥生，江东 

【目的】通过生物信息学分析U-box在柑橘基因组中的分布、结构及进化，研究家族成员在不同组织中的表达特异性以及对非生物胁迫和激素的响应，解析柑橘U-box基因家族的生物学功能。【方法】根据已经报道的拟南芥U-box基因，利用Phytozome数据库中的BLASTp工具鉴定柑橘基因组中的U-box基因。采用MEGA6.0、Cello、SMART、GSDS2.0、ExPASy和MapChart等软件构建系统进化树、亚细胞定位预测、预测蛋白的相对分子质量与等电点等理化性质、绘制家族成员Scaffold定位图等，分析U-box基因家族在低温胁迫下表达模式，利用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）检测柑橘U-box基因家族部分成员在NaCl、PEG6000和不同激素处理下的表达情况。【结果】从柑橘克里曼丁（Citrus clementina）全基因组中鉴定出56个CcPUBs基因家族成员，可将其分为7类，即U-box only、U-box+ARM-1、U-box+WD40-1、TPR+U-box、Kinase+U-box、U-box+ARM-2和U-box+WD40-2。该家族蛋白理论等电点分布在5.19—9.14，编码的氨基酸数目介于281—1 441；亚细胞定位预测结果显示该基因家族成员位于细胞不同位置，主要位于细胞核或叶绿体，少数位于质膜；聚类分析发现，柑橘U-box与单子叶植物水稻的亲缘关系较远，柑橘中具有相同结构域的成员和拟南芥具有相同结构域的成员聚在一起，表明柑橘U-box成员具有不同生物学功能；Scaffold定位分析发现，56个U-box成员分布在1—9 Scafflod上且呈不均分布。在冷胁迫下的RNA-Seq分析结果表明，U-box基因家族参与植物对冷胁迫的应答，并表现出4种不同的应答模式；从柑橘U-box基因家族的5个不同簇上分别选取1个代表基因进行qRT-PCR，分析结果表明，CcPUB48在金柑的各个组织中均有表达，CcPUB9和CcPUB4主要在茎和花中表达，CcPUB10主要在花、茎和幼果中表达，CcPUB41主要在叶和茎中表达，体现了不同U-box成员的组织特异性的表达差异。CcPUB4、CcPUB10和CcPUB41在NaCl胁迫下表达均上调，而CcPUB48在盐胁迫下的表达无明显变化。CcPUB4在Na₂CO₃处理下表达明显上调，与NaCl处理存在一致的表达趋势，而CaCl₂处理下的表达与NaCl处理下的表达趋势却存在差异。在PEG6000的处理条件下，CcPUB4的表达量呈现先上升后下降的趋势，CcPUB9、CcPUB41和CcPUB48在PEG6000的处理下无明显变化。在赤霉素（GA₃）处理下，CcPUB4在3 h时明显上调，在生长素（IAA）和脱落酸（ABA）下呈现无规律变化，CcPUB10在ABA处理下表达量表现出逐渐上升。【结论】从柑橘克里曼丁全基因组上鉴定出56个U-box基因成员，各成员均含有U-box保守结构域，并位于细胞的不同位置。U-box基因家族参与植物对冷胁迫的应答并表现出4种不同的应答模式，在NaCl、PEG6000和激素处理下，CcPUB4和CcPUB10有不同程度的响应，而CcPUB9、CcPUB41和CcPUB48响应不明显或未响应。

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往期回顾
《中国农业科学》蔬菜研究合辑 （2018-2019）
《中国农业科学》苹果研究合辑 （2018-2019）
JIA 2018 园艺栏目之分子生物篇
JIA 2018 园艺栏目之栽培生理/资源品质篇

《中国农业科学》是中华人民共和国农业农村部主管，中国农业科学院与中国农学会共同主办的综合性、学术性半月刊。最新核心影响因子为1.896，总被引频次达到11663，综合评价总分在农业综合类科技期刊中排名第一。本刊设有“作物遗传育种•种质资源•分子遗传学；耕作栽培•生理生化•农业信息技术；植物保护；土壤肥料•节水灌溉•农业生态环境；园艺；食品科学与工程；畜牧•兽医•资源昆虫”等栏目。

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