读文献：癌症中的m6A修饰：分子机制及潜在临床应用
RNA m6A Modification in Cancers: Molecular Mechanisms and Potential Clinical Applications
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666675820300692
从20世纪50年代起， RNA核苷酸的化学修饰不断被发现，这些修饰可以改变RNA结构，导致生物学功能的改变。在真核生物中已鉴定出许多种类的RNA修饰（图1）。N6-甲基腺苷（m6A）RNA修饰于1974年首次被发现，它被定义为腺苷酸N6位置上的甲基化，为RNA修饰研究带来了新的曙光(new dawn)。m6A被认为是最丰富的mRNA修饰，广泛分布在大多数真核生物中，包括哺乳动物、植物、昆虫、酵母和某些病毒。“writers”，“ erasers”和“readers”蛋白的鉴定和识别，以及近年来高通量测序技术的发展，为RNA修饰尤其是m6A RNA修饰提供了新的研究视野。
在哺乳动物中约有三分之一的mRNA中发现了m6A，每个mRNA平均有3到5个m6A修饰。值得注意的是，在人类和小鼠的m6A位点是进化保守的。转录组m6A修饰的定位不是随机的，具有特征性DRACH序列（D = G，A或U; R = G或A；H = A，C或U），通常在3'非翻译区 (3'UTR)和编码序列(CDS)。此外m6A修饰几乎存在于所有类型的编码、非编码ncRNA, 并且动态调控相应分子机制、生理、病理功能。在这篇综述中，我们强调了m6A修饰在肿瘤发生中的潜在机制，并进一步介绍了潜在的与m6A调节器相关的肿瘤治疗靶点。
m6A动态调节
RNA m6A修饰可动态、可逆地调控通过两个重要的催化蛋白：甲基转移酶和去甲基酶，或者叫做“writers”，“erasers”。此外，一组结合蛋白（“readers”）用于解码m6A修饰，并募集下游功能复合物（图2）
m6A的Writer蛋白
RNA m6A修饰“writers”蛋白是一类甲基转移酶，由METTL3、METTL5、METTL16，含锌指的CCHC型4(ZCCHC4)和其他伴侣蛋白，例如METTL14，Wilms肿瘤1相关蛋白(WTAP)，Vir类 m6A甲基转移相关酶(VIRMA)，含CCCH的锌指型13 (ZC3H13)和RNA结合motif 15/15B(RBM15/15B)。
METTL3在1997年被发现，其异常表达通常会影响 m6A甲基化。同时METTL14发挥METTL3的协同伴侣作用，提供METTL3的结构支持，他们结合成核心甲基转移酶复合物，从而促进与RNA结合。WTAP的主要功能是结合METTL3/METTL14复合物，是募集适合底物所必需的， 并参与METTL3/METTL14复合物的定位。RBM15/15B被证实有助于METTL3与WTAP之间结合，通过结合U-rich区域。HAKAI，也称为CBLL1，有助于调控核m6A甲基化。ZC3H13的功能类似于CBLL1，有助于核定位。VIRMA对于m6A修饰非常重要，尤其是位于 3'UTR和终止密码子周围的序列。
在所有m6A甲基转移酶中，METTL5，METL16和ZCCHC4的功能可以独立于其他甲基转移酶。如METTL5，它被鉴定为一种独立的m6A甲基转移酶，可在某些结构性RNA上进行m6A修饰，包括18S rRNA, 28S rRNA和U6核小RNA(snRNA)。METTL5形成了带有TRMT112的异二聚体复合物的特殊结构，可以增强其代谢稳定。同时，TRMT112作为METTL5的共激活因子，METTL5与TRMT112之间的关系是类似于METTL3和METTL14之间的关系。此外，METTL5-TRMT112复合物的原子分辨率结构证明了，该复合物的RNA结合模式与其他m6A RNA甲基转移酶不同。与METTL5类似，METTL16也是被证明为独立的m6A甲基转移酶，其结合位点与METTL3/METTL14复合物没有重叠，调节mRNA的稳定性和剪接。因此，对催化结构域突变的METTL16进行过表达，激活了剪接过程。此外，METTL16据报道可以与U6 snRNA，许多ncRNA(ncRNA)，长链非编码RNA(lncRNA)和pre-mRNA结合。关于ZCCHC4，已被鉴定为RNA m6A甲基转移酶，甲基化人28S rRNA。此外，被ZCCHC4介导的rRNA m6A甲基化改变了核糖体亚基的分布，翻译和细胞增殖，当ZCCHC4表达异常时，这可能导致肿瘤发生。
m6A的Eraser蛋白
作为去甲基化酶的m6A“erasers”蛋白, 通过提高亚铁作为辅因子同时将α-酮戊二酸酯作为共底物,来去除m6A修饰。与众多类型的m6A writer蛋白不同，到目前为止，已经鉴定出两种m6A去甲基酶，包括脂肪量和肥胖相关蛋白(FTO)和AlkB同系物5(ALKBH5)蛋白。此外，m6A“erasers”蛋白m6A去甲基化通常发生在细胞核中。
FTO是第一个被确认的m6A“erasers”蛋白，属于AlkB家族，介导的m6A去甲基化不仅可以是internal m6A，而且可以是N6，2ʹ-O-二甲基腺苷(5ʹcap m6Am) mRNA。此外，FTO几乎在所有细胞系中广泛核定位, 并调节了10%的总m6A修饰，而mRNA内部m6A修饰则是FTO的主要底物。更进一步，FTO在大脑（一种代谢活跃的器官）中高表达。当然，可逆的m6A修饰在这些过程中也起着重要作用。最近的一项研究表明，NADP直接结合FTO，独立增加FTO活性，促进RNA m6A修饰的去甲基化和脂肪形成。FTO的发现证明m6A甲基化的过程，在生理和病理状态下是可逆的，可控的。
另一个“erasers”蛋白是ALKBH5，与FTO具有功能相似性。ALKBH5在各种组织中广泛表达，尤其是在睾丸中。FTO和ALKBH5在不同组织之间的差异表达揭示了这两种蛋白质在不同生物功能上各自发挥作用。具体来说，m6A是迄今为止ALKBH5的唯一已知底物。ALKBH5的晶体结构更令人鼓舞，为m6A识别和去甲基化过程的潜在机制提供了新视野。以上发现大大促进了m6A去甲基化抑制剂靶向药物的开发。
m6A的Reader蛋白
m6A介导的转录后基因调控，已经通过“readers”蛋白被进一步理解和确定。m6A“readers”蛋白控制着修饰后的RNA命运。因此，蛋白质的失调可能会导致误解结合修饰的RNA和随后的RNA代谢紊乱。m6A阅读器蛋白包括：由YT521-B同源性(YTH)组成域家族蛋白(YTHDF1-3)，YTH域包含蛋白(YTHDC1-2)，胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白(IGF2BPs)和核不均一核糖核蛋白(HNRNPs，包括hnRNPA2B1，hnRNPC和HNRNPG)。
CCR4-NOT去乙酰基酶复合物介导m6A修饰的RNAs去腺苷酸化。细胞质YTHDF2，与CNOT1亚基的SH结构域相互作用，募集CCR4-NOT复合物，然后使m6A修饰的RNA不稳定，从而导致它们的去甲腺苷酸化和降解。相反，其他两个YTH域家族蛋白YTHDF1和YTHDF3可以通过募集翻译起始因子来促进翻译。此外，YTHDF3可以通过与YTHDF1结合促进mRNA翻译，并与YTHDF2协作促进m6A修饰的RNA去腺苷酸化和降解。
在细胞核中，YTHDC1通过募集并结合某种剪接因子富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子3(SRSF3)来调节mRNA剪接。此外，YTHDC1还有助于mRNA出核。最近，人们发现YTHDC1，通过核外泌体靶向复杂介导的核降解，加速了部分m6A修饰的染色体相关条件RNA(carRNAs)的降解，尤其是LINE元件。YTHDC2增强了靶RNA的翻译，同时减少其在细胞质中的丰度。
目前，IGF2BPs被证明在正常和应激情况下，通过m6A依赖的方式可以维持稳定mRNA的结构。HNRNPA2B1识别primary microRNA的m6A信号，并与DiGeorge综合征关键区域相互作用基因8(DGCR8)交互。而在mRNA二级结构上选择性识别m6A依赖性剪接，这些被证明是HNRNPC的功能。
癌症中的m6A
先前的研究表明m6A修饰影响调节和协调基因表达的能力。m6A水平可能会深远影响癌症的特性，表明m6A可能在恶性肿瘤的发生或抑制中起重要作用。一些蛋白质(的mRNA)需要被m6A修饰才能参与致癌的机制，但尚不清楚它们是否在修饰中起作用。依赖m6A的肿瘤发生主要原因（图3）和在大多数肿瘤类型中m6A主要蛋白的功能已显示（图4）
Hepatocellular Carcinoma
肝细胞癌(HCC)是最常见的肝脏原发肿瘤。Chen等人发现METTL3可以通过YTHDF2依赖性转录调控SOCS2沉默，促进肝癌细胞的进程。进一步的研究表明METTL14与DGCR8相互作用并正调控miRNA 126的表达。METTL14的过表达可抑制小鼠肝癌细胞的转移。根据这些结果，他们推测METTL14可能通过m6A修饰来调节miRNA 126的表达，然后调节其下游靶点以抑制HCC的转移。因此，METTTL14可能是HCC重要的不良预后因素。对于IGF2BP家族，IGF2BP1，IGF2BP2和IGF2BP3均被鉴定为促进肝癌致癌的癌基因。YTHDF2不仅充当肿瘤激活蛋白，而且还充当充当肿瘤抑制蛋白。一些研究表明，缺氧可以诱导肝细胞癌中YTHDF2表达的降低。他们还发现YTHDF2的过量表达抑制了HCC细胞增殖并激活MEK和ERK。YTHDF2可以直接作用于EGFR mRNA的3'UTR m6A修饰位点，导致EGFR mRNA降解。另外，低氧诱导的ERK磷酸化也可被YTHDF2阻断，表明缺氧可以下调YTHDF2诱导的ERK磷酸化。YTHDF2通过降低EGFR mRNA的稳定性，抑制ERK/MAPK信号转导，从而抑制了肝癌细胞的增殖。WTAP的表达被检测，以确定它是否与HCC患者的临床病理因素有关，结果表明WTAP的表达水平在肝癌中比癌旁组织高，并与预后不良相关。此外VIRM也被认为是肝癌的促癌基因。
Colorectal Cancer
结直肠癌发生的各个方面都存在表观遗传学改变。在结直肠癌中，METTL3以m6A-IGF2BP2/3依赖性方式发挥致癌基因功能。致癌基因c-Myc可以促进YTHDF1的表达，诱导癌细胞的增殖和侵袭，并增加其对化疗药物的耐药性。敲除c-Myc可抑制结直肠癌中YTHDF1的表达，通过HIF-1a。YTHDF3可以在体内或体外，通过GAS5-YAP-YTHDF3轴负调控lncRNA GAS5。YTHDC2的表达和结肠癌的分期和转移呈正相关。在体内和体外敲除YTHDC2的表达，可通过HIF-1a抑制肿瘤细胞的侵袭。除上述所有与m6A相关的癌基因外，METTL14被证明是一种肿瘤抑制因子，可通过不同的分子机制降低结直肠癌的增殖和侵袭。
Pancreas Cancer
胰腺癌被认为是一种高度恶性肿瘤恶性肿瘤。He等人揭示ALKBH5可能是潜在的胰腺癌治疗靶点，通过下调lncRNA KCNK15-AS1的甲基化，和抑制细胞迁移。
Taketo等人发现，METTL3低表达的胰腺癌细胞对放疗、化疗药更敏感，比如吉西他滨，5-氟尿嘧啶和顺铂，这为潜在的靶向治疗提供了可能。胰腺癌的治疗。许多研究证明，IGF2BP2在胰腺癌中过表达并促进癌症扩散。一项病例对照研究表明，FTO变异体与胰腺癌的风险有关。YTHDF2可促进增殖，同时抑制胰腺癌细胞的迁移和侵袭。
Gastric Carcinoma
通过改善诊断策略，诊断为早期胃癌(GC)的人数正在增加。以前研究表明，表观遗传学可能在GC的发生和进展中起重要作用。Li等人通过挖掘TCGA数据库，证明了高表达的FTO和ALKBH1 mRNA提示与GC不良预后相关。METTL3通过促进HDGF mRNA稳定性和激活AKT信号通路，从而促进血管生成和糖酵解。ALKBH5通过减少lncRNA NEAT1的甲基化，促进GC的侵袭和转移。一些研究表明，IGF2BP3作为癌基因可促进GC的肿瘤进展。敲除METTL14（抑制m6A）促进GC发展，通过激活Wnt/PI3K-AKT信号通路，然而增加m6A水平逆转了这些表型和分子变化。
m6A在癌症治疗的应用
许多研究人员证明，m6A已成为在多种病理途径中，基因异常表达的广泛调控机制，导致肿瘤发生。因此，m6A调节蛋白可作为癌症的潜在临床治疗靶标。自从发现第一个m6A去甲基化酶FTO以来，FTO已成为开发针对肿瘤的靶向药物的最引人注目的目标。已经开发了几种针对FTO的抑制剂，包括MO-I-500，甲氯芬那酸（MA），FB23，R-2HG，大黄酸等。MO-I-500，是选择性抑制剂，抑制FTO的酶活性，据报道可以抑制乳腺癌细胞系的增殖。MA也被证明是通过抑制FTO治疗GBM的选择性抑制剂。最近，FB23和FB23-2被设计为小分子FTO抑制剂，在AML中具有显着的抑制作用。对于FTO的非选择性抑制剂，大黄酸是第一个被发现，可竞争性结合FTO的特定位点。167R-2HG由突变型异柠檬酸脱氢酶1/2（IDH1 / 2）酶高度表达，被证明在神经胶质瘤和白血病中起重要的抗肿瘤作用。
总结及展望
与DNA不同，RNA的转录后加工更为复杂：RNA剪接，RNA编辑和RNA化学修饰。 RNA化学修饰，大多数对序列没有影响，在结构上是多样的，在功能上是多重的，表明它们功能上的重要性。
近年来随着检测方法和高通量测序技术的飞速发展，表观遗传学，尤其是RNA m6A修饰让我们有了进一步了解和探索。广泛研究表明，m6A修饰的失调与各种类型的癌症以及对耐药性相关。然而，随着证据（m6A在 肿瘤）开始积累，m6A在癌症的潜在机制仍未完全清楚。具体来说，有很多种非小细胞肺癌，乳腺癌，急性粒细胞白血病等癌症，和一些妇科肿瘤，过表达“writers”，“ erasers”蛋白可以发挥促癌作用，而这些蛋白在其他癌症类型中也存在相反作用。某些特定基因位点的m6A RNA修饰可作为与肿瘤预后、分子分型和精确诊疗相关的生物标志物。多种研究关注于癌症中mRNA的m6A修饰，但是m6A修饰如何影响ncRNA的功能仍不清楚。2020年诺贝尔化学奖颁给“基因编辑方法的发展”（发现CRISPR / Cas9基因剪刀）。因此，是否可以开发用于转录组编辑的技术也值得期待。
考虑到m6A调节蛋白的失调与耐药性和癌症免疫相关，发展基于m6A的肿瘤疗法靶向药物具有很强吸引力。