FDA新宠——外泌体治疗候选药物
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2019年1月4日, 一家总部位于英国的外泌体技术平台开发全球领导者ReNeuron宣布已与一家美国生物制药公司签署合作协议, 准备开发以外泌体作为人工合成的寡核苷酸的潜在载体来进行基因治疗。其实早在2013年因发现细胞囊泡作用机制荣获诺贝尔生理学或医学奖，外泌体逐渐进入人们的视野并一度成为研究的焦点。
外泌体仅由活细胞分泌,通常以胞内体逆出芽形成多囊泡胞内体，然后多囊泡胞内体与细胞膜融合并向细胞外释放而形成，与凋亡细胞产生的微泡有着显著的区别。几乎所有的哺乳动物细胞，包括干细胞，免疫和神经系统的原代细胞以及许多癌细胞，都会分泌外泌体。由于外泌体包裹多种成分，如蛋白质、脂质、RNA，因此除了排泄细胞不需要的蛋白质功能之外，还发挥其他重要生物学功能：
抗原特异性作用：由抗原呈递细胞（APC）分泌的外泌体以抗原特异性方式刺激人体CD4 + T细胞增殖。外泌体也可以将抗原转移到DCs，可刺激T细胞或者使其耐受，而且抗肿瘤免疫应答程度取决于DC的成熟状态。另外有趣发现的是，源自DC或肿瘤细胞的外泌体不诱导DC成熟。
抗原非依赖性作用：研究发现通过体外培养的肥大细胞衍生的外泌体与自体脾细胞放置一起，可诱导其活化，促进胚细胞形成，细胞增殖以及IL-2和IFN-γ等细胞因子的产生。 这种抗原非依赖性作用的机制目前尚不清楚，可能涉及CDC25，它是一种在有丝分裂过程中有活性的蛋白质。
抗原非依赖性免疫抑制作用：B细胞（由EBV转化）分泌的外泌体中存在一种病毒潜伏膜蛋白（一种抑制植物血凝素，抗CD3/CD28），可诱导T细胞增殖。这显示外泌体在激活并扩散T细胞死亡信号中起关键作用，能够阻止潜在的自身免疫损伤。
外泌体介导肿瘤免疫逃逸
细胞外泌体以多种方式对人体基本生理过程发挥作用。一般通过蛋白质或者生物活性脂质配体直接激活细胞表面受体，将其膜内容物合并到受体细胞质膜中，然后将效应物（包括转录因子，癌基因，非编码RNA（例如miRNA），mRNAs和感染性颗粒）递送到受体细胞中，使其产生免疫反应、代谢等生理过程。如对免疫反应的调节，通过几种机制赋予免疫抑制：增强调节性T细胞的功能、抑制自然杀伤细胞（NK）和CD8+细胞活性、抑制单核细胞分化成DC以及DC成熟等机制；对脑部免疫活动的调节主要是通过皮质神经元增加释放带有神经递质受体的外泌体量来提高谷氨酸能活性。利用该转移特性，外泌体也可以调节细胞表型，如可以将造血干细胞表型转化为肝细胞表型。
外泌体来源及内容物
并不是所有细胞分泌的囊泡都可称之为外泌体，外泌体的直径一般为 30-90 nm，密度 1.13-1.19 g/ml。一般采用超速离心法提取外泌体，其将细胞培养上清液通过0.22 um孔径大小的过滤器，然后直接进行超速离心，一方面可以减少外泌体制剂的污染，同时又能够使其中较大的囊泡从滤液中有效分离。目前外泌体治疗市场存在一个关键技术阻碍：一种有效的外泌体提取和纯化工艺技术，可以规模化生产药品级外泌体治疗产品供临床使用。
Exopharm的LEAP技术采用亲和层析法可以从成体干细胞或其他来源中分离和纯化外泌体，可以很大程度上解决目前外泌体纯化过程中存在的局限性。亲和层析法是利用分子之间的特异性结合相互作用，将一种分子与另一种分子分离的科学方法。当复杂混合物通过柱时，靶分子被互补结合物质（配体）特异性且可逆地结合，然后将未结合的物质从柱中洗出，分离并回收结合的分子。
外泌体是纳米级大小的膜封闭囊泡，含有生物活性分子，包括蛋白质，RNA和miRNA。它们充当信使来调节邻近细胞的功能。临床前研究表明，在某些情况下，外源性给予的外泌体可以重新指导细胞活动，从而发挥其治疗潜力。由外泌体介导的递送具有以下几个优点：1、具有高度生物相容性，如果它们来自适当的细胞（例如间充质干细胞（MSCs）或未成熟的DC），则同时具备免疫惰性；2、能够穿越人体厚实的组织屏障，如血脑屏障（BBB）等。 正常情况下，外泌体可以直接用作和免疫调节的潜在治疗剂。
1、外泌体直接作为组织再生治疗剂
细胞通常通过外泌体进行通信，细胞释放的纳米大小的“信息包”被附近的其他细胞吸收。这些“信息包”含有多种蛋白质，遗传物质和其他能够诱导受体细胞功能变化的载体。在某些条件下，干细胞产生的外泌体具有修复和再生功能。在不同的细胞的状态及其环境刺激下，干细胞具有传递不同信息并诱导不同功能变化的能力。外泌体作为再生疗法药物具有以下优点：
通常发现干细胞衍生的外泌体比细胞具有更低的免疫原性。因此，可以使用具有可忽略的免疫原性的 外泌体可以更容易地开发“现成”产品。
外泌体可以在没有冷冻防腐剂的情况下，在-20°C下储存6个月，同时不会损失其生化活性。
外泌体的一个重要特征是包封，可以保护其内容物免于降解，从而防止某些活性成分快速降解。
外泌体在培养物中的耐久性允许从细胞培养基中富集大量外泌体。
通过改变细胞环境，来改变外泌体功能。
在2018年4月，美国食品和药物管理局（FDA）批准了Aegle公司的首个细胞外囊泡新药（IND）申请，以开始用于烧伤患者的临床试验。该公司通过专门的技术分离纯化间充质干细胞分泌的细胞外囊泡（EV），以治疗严重的皮肤病，包括烧伤和大疱性表皮松解症。由于传统技术的分离过程会对EV造成结构或功能损坏，可在猪伤口模型中引发免疫反应，导致不良炎症和伤口无法愈合；然而采用该公司技术得到的EV，在同一模型中可加速愈合，最小化/消除疤痕，并促进血管和神经再生以及毛囊生长。
ReNeuron公司拥有两大核心干细胞技术：CTX神经细胞系和人视网膜祖细胞（hRPC）。目前该外泌体平台正在通过一系列潜在适应症产生令人鼓舞的早期临床前数据。该公司第一个CTX神经细胞衍生的外泌体治疗候选药物，在设计的临床前疾病模型中已经证明既可作为新型治疗物也可作为药物递送载体。
2、外泌体可作为药物递送的载体
外泌体的两个固有特征为药物递送提供了巨大潜力：它们的膜组成和免疫沉默性质。1、外泌体的复杂膜组成允许它们传递生物信息，从而以两种方式改变受体细胞的行为（通过有效地进入靶细胞或通过与细胞表面上的蛋白质相互作用）。2、外泌体本质上被认为是逃避免疫系统，身体允许外泌体穿过，如血脑屏障 （BBB）由于其独特的能力，越来越多地研究人员将外泌体视为药物递送的载体。
外泌体科学领域的领先公司---Capricor，拥有从心脏球源细胞（CDC）中分离纯化外泌体技术。项目 CAP-2003提供了独特的潜力，不仅可以作为提供治疗的载体，还可以作为治疗药物。临床前研究表明CAP-2003具有治疗炎症和纤维化疾病、Duchenne肌营养不良症的潜力，发现它们可以减少细胞死亡并减少纤维化或瘢痕形成。
Codiak也建立了一个专有的外泌体工程和制造技术平台，可以实现精确的靶向治疗，为治疗疾病的开发打开了大门，解决目前难以或无法治疗的各种疾病。该公司的平台能够设计具有针对特定细胞内靶标的单个和多个有效载荷的外泌体。通过纳米级膜囊，可将蛋白质，脂质，核酸和小分子输送到各种细胞类型。目前Codiak正在在德克萨斯大学安德森癌症中心开发一种新型胰腺癌治疗候选药物。
3、外泌体作为肿瘤发生的早期“哨兵”
外泌体的精细调节的方式反映了活细胞释放纳米膜囊泡的重要性。这些微小的脂质囊泡可作为亲本细胞的真正替代品：它们携带特定的有效载荷（蛋白质，脂质，核酸等）。因此选择性分离和分析循环肿瘤来源的外泌体，可以使真正的非侵入性肿瘤组织活检成为可能（见表 1）。目前的癌症诊断总是伴随着高成本和相当大的患者不适，筛查测试仅适用于少数实体肿瘤，并且缺乏适当的工具和生物标记物，造成大多数肿瘤在早期阶段未被检测到。
Exosome Sciences公司与Aethlon Medical（纳斯达克代码：AEMD）合作，发现基于外泌体的生物标记物，用于诊断和监测阿尔茨海默病（AD），慢性创伤性脑病（CTE）和其他神经系统疾病。目前正在推进TauSome™生物标志物（也称为外泌体tau）作为血液检测的基础，以诊断个体的CTE情况。慢性创伤性脑病（CTE）是一种在运动员，退伍军人和其他具有重复头部撞击史的人中发现的大脑疾病，这种类型的创伤可以引发脑组织的进行性退化，包括形成一种叫做tau的蛋白质的异常形式。在最近的一项研究中，观察到与同龄对照组相比，NFL球员的TauSome水平显著升高。高TauSome水平也与评估认知下降等不良表现相关。该研究的初步结果发表在阿尔茨海默病杂志上。
表1 外泌体内容物作为肿瘤的潜在诊断标志物
肿瘤类型 | 外泌体来源 | 潜在标志物 | 标志物种类 |
食道癌 | 血清 | miR-21 | miRNAs |
肺癌 | 血浆 | miR-let-7f、miR-30e-3p、miR-223、miR-01 | miRNAs |
乳腺癌 | 血清 | miR-200a、miR-200c、miR-205 | miRNAs |
肝癌 | 血清 | miR-21 | miRNAs |
前列腺癌 | 尿液/血清 | miR-141 | miRNAs |
宫颈癌 | 阴道灌洗液 | miR-21、miR-146a | miRNAs |
胰腺癌 | 血清 | mutated KRAS DNA | DNA |
胃癌 | 血清 | HOTTIP | lncRNAs |
总之，近几年对外泌体的研究文章数量呈井喷式发展，无论是它的提取工艺还是作为新型的疾病诊断标志物、纳米药物载体、以及治疗试剂和药物作用靶标都有了全面的认识。相信在新的一年里，外泌体有希望成为人们通向健康大门的桥梁，让我们拭目以待!
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参考来源：
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2.Raposo, G. and W. Stoorvogel (2013). "Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends." J Cell Biol 200(4): 373-383.
3.S, E. L. A., et al. (2013). "Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities." Nat Rev Drug Discov 12(5): 347-357.
4.Colombo, M., et al. (2014). "Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.
5.Kourembanas, S. (2014). "Exosomes: Vehicles of Intercellular Signaling, Biomarkers, and Vectors of Cell Therapy." Annu Rev Physiol.
6.Yáñez-Mó, M., et al. (2015). "Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions." J Extracell Vesicles
7.Budnik, V., et al. (2016). "Extracellular vesicles round off communication in the nervous system." Nat Rev Neurosci 17(3): 160-172.
8.Tkach, M. and C. Thery (2016). "Communication by Extracellular Vesicles: Where We Are and Where We Need to Go." Cell 164(6): 1226-1232.