一个无法高声哭泣的悲剧
今晚就是双十一，这是中国人发明的伟大节日。每年这天，海量交易像火山一样爆发出来。所有人都在买卖，大家都很开心，连忙碌的快递小哥也能多赚一笔。和许多读者一样，我也在淘宝囤许多东西。然而今天我看到一则新闻，热烈的情绪被打消下来。
这则新闻的主角正是一位淘宝店主，她的名字叫游燕。游燕从去年起就参加不了双十一活动，因为她被抓了，现在监狱里服刑。前些天的11月1日，游燕的淘宝店贴出道歉信，表示自己无力为顾客服务，如有未尽事宜，联系她的丈夫。
2006年起，游燕为了照顾孩子，在家淘宝开店，每月有几千元收入。她卖的衣服，最开始主要是国产服装。2014年起，游燕就经常往香港跑，从香港市场拿衣服回来卖。生意非常好，每年算下来能有一百多万收入。淘宝店升到两皇冠，雇了两人。她的孩子也已经在读高中。
2017年春天游燕从香港返回内地，在海关被抓。辑私局上门抄走电脑和单据，带走两名员工。一切很清楚，走私普通货物数额巨大，一审判罚十年徒刑，处罚金550万。上诉之后，二审维持原判。
法院认定数额是根据信用卡纪录，高达1100多万。游燕说很多金额是私人消费，也帮别人带货，怎么全算呢？律师说，即便如此，以她走私的数额，这样的判决并不算重。
游燕的家庭全毁了，读高二的孩子成绩下滑，今年马上就要高考；丈夫变卖家产，借债认罚；母亲哭瞎双眼、瘫痪在床…人间悲剧。
也许如律师所说，依照现有法律，游燕不算冤枉。不过我非常同情她，这件事情是一出纯粹的悲剧。
游燕没有伤害任何人。她自己掏钱买机票，跑到香港，花钱挑选和购买商品，像蚂蚁搬家，一趟趟搬回来，挂在自家网店出售。她的辛勤劳动伤害了谁？没有任何人。
不只没有伤害，她还帮助到别人。香港商人感谢她，有长期照顾生意的主顾，谁不喜欢？购物者不用跑香港，就能称心如意地消费，他们也满意。从淘宝店等级能看出来，游燕的生意很受欢迎。
快递小哥也是受益者，每一单发货，他都能赚些钱。当然，游燕本人也因代购而发财，全家人过上好日子。这是市场对聪明勤劳者的奖赏。
无论从香港拿货，还是国内其他城市，事情的本质没有变。游燕和国内普通商人没什么不一样，差别仅在于，进货地点在香港，需要缴一笔关税。游燕用蚂蚁搬家的方式，逃掉了这一笔税钱。
这笔关税一共多少呢？以1100万的货值算，计税305万，税率26.36%。只是卖个衣服，要交那么高关税，算下来我自己都吓一跳。
这就是经济学家常说的关税之恶。由于关税存在，大量生意阻断，许多福利消失。如果游燕老老实实缴税，根本不会有这一桩生意，不存在所谓「税收流失」。走私客以身犯险，帮人们促成交易，最后成为关税牺牲品。这样的悲剧发生得太多。
2013年，一位离职空姐因多次从韩国免税店买化妆品入境，逃税113万，一审判处有期徒刑11年，罚金50万，舆论哗然。许多偷盗抢劫伤害的案件，都没如此重判。从海外代购，居然判这么重？
案件发回重审，刑期改3年，罚金改4万元。判罚力度大大减少，还是有人觉得冤。不偷不抢不害人，只是做点小生意，却要锒铛入狱。
打击代购这件事，海关边检的执法有松紧。有时查得松，多带几样无妨；有时尺度非常紧，开箱验货，逐一核查。这样的执法尺度下，难免有人被抓。新闻上经常能看到，一些代购过关被抓，奶粉、化妆品、手机撒一地，人俯在地上嚎啕大哭。此时情景，让人恻隐动容。
今天社会，代购被抓是一个无法高声哭泣的悲剧。稍有辩解，很多人会拿出法律，代购就是走私，国法凛然无情。可站在天理人情来看，他们的遭遇很难不让人同情。
无数经济学家证明，关税损害贸易双方，走私纯粹是国家的认定。时代发展的趋势，是关税取消，壁垒拆除，商人和货物自由往来。只要自贸协定一签订，就没有所谓的走私。
因代购被抓被判刑的人们，他们造福他人，不幸倒在旧法时代。正如我们今天回看三十年前，那些因投机倒把罪入狱的人们，他们是那个时代的英雄。
在贸易这领域，希望真正的自由贸易早日到来，以免徒增人间悲剧。
拓展阅读
做了3年淘宝代购店，如今因走私逃税被判刑10年，并处罚金550万。
这张某淘宝代购店主的道歉信截图被放到网上后，顿时引发了诸多争议。
一开始网友还不肯相信，直到有人翻出了店主写的道歉信。
据判决书显示，2013年，被告人游燕开了名为“TSHOW进口女装店”的淘宝店用于销售进口高档服装，同年开始通过快递邮寄，雇请“水客”偷带及自行携带等方式走私进境，并销售牟利。
2017年3月20日，游燕在进境时被九洲海关缉私分局抓获，同年4月27日，游燕以“涉嫌走私普通货物、物品罪”被逮捕。
2018年2月24日，广东省珠海市中级人民法院一审游燕犯走私普通货物罪，被判有期徒刑十年，并处罚金人民币五百五十万元。
7月18日，广东省高级人民法院二审维持原判。
经统计，被告人游燕在香港刷卡购买并走私进境的服饰金额总计人民币11400558.93元，经核定，上述服饰偷逃税款共计人民币3005187.33元。
走私了价值1000多万元的服饰，逃了300多万元的税，终审被判刑10年，罚款550万元。
这个量刑结果引发了网友的争议。有网友疑问，相比其他恶性犯罪，这个是不是判太重了？
律师表示，据《刑法》规定这已是最低的量刑。这还是法院考虑到游燕认罪态度好的前提下给出的判决。
因为游燕不仅是逃税，更涉及走私。
她从香港买货，然后带入境，在国内销售，谋取利润，游燕偷逃应缴税额300余万元，税额特别巨大，已经构成了走私普通货物罪。
而根据《刑法》的有关规定，偷税250万元以上的，就属于“偷逃应缴税额特别巨大”。数额特别巨大。
而走私货物、偷税数额特别巨大的，处10年以上有期徒刑或者无期徒刑，并处偷逃应缴税额1倍以上、5倍以下的罚款。
政策收紧——加紧囤货——商品紧缺——促使限购等政策进一步收紧……如此循环，代购日子越难越难过。
不代购，直接海淘？即使你邮寄包裹回国，也是有可能被海关调查的！
据悉，如果包裹总值超过2500人民币就需要缴税。
同时，中国海关将正式使用微信APP身份验证系统，对真实收件人信息进行随机核查，如果不接电话或者胡乱回答会导致包裹延误甚至扣关。
《中华人民共和国电子商务法》（简称《电商法》）将在明年1月1日正式实施，其中明确规定，所有电子商务经营者都应当办理市场主体登记，且依法履行纳税义务，电子商务经营者未取得相关行政许可从事经营活动的，将依照有关法律、行政法规的规定处罚。
律师强调，在国外、在香港买了商品，没有经过海关报关，而直接把这些商品拿到国内再进一步销售，看起来是一个代购行为，实际上是符合了国家法律规定的走私普通货物罪的构成要件。
当你代购的产品没有经过海关，没有缴纳关税，达到一定额度了，就会构成走私普通货物罪。
简而言之，海购、代购等行为是否构成走私，要看货物过关时的所有人或者收货人是否向海关如实申报货物的种类、价格、用途等信息，并依法交税或者免税过关。如果未申报也未标注的话，海关默认你申报的是个人自用的免税物品，如果其实不是，那也算虚假申报。
灰色代购们看来已经完成了自己的使命，在大势面前，请千万别再铤而走险了。
摘在生态毒理学受试生物研究上，国内外已经开发了多种受试生物品种，如斑马鱼，大型溞，浮萍，虹鳟，牡蛎，稀有鮈鲫和青鳉等[135-141]，但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少，河蚬作为中国本土的底栖物种，分布广，敏感性强，易取样，能直接反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术，克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin），Conopressin神经肽和FF神经肽基因，并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯，筛查敏感的神经肽标志物，为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制，为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术路线 第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种，陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因，如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中，我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况，两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标，本研究提供了河蚬miRNAs数据，为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖，养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取，然后在3’和5’接头加上测序序列，接着进行反转，建库，PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA，加接头，最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤，评估序列质量去除低质量序列和3’接头，5’接头和多A序列，计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA，tRNA，snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定新miRNAs：碱基的数量为18到24，自由能≤-20 kcal/mol，并且miRNA从一个前体端产生。Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被认为是miRNA*。 2.2.4 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs，我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs，以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况，总RNA使用miRcute miRNA First-strand cDNA Synthesis Kit (TianGen, China)试剂盒来提取，定量液使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green; TianGen, China)，定量仪使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technology, USA)，定量引物使用miRprimer软件[146]设计，见表2-1。 表2-1 河蚬miRNA定量使用的引物 miRNA forward primer(5’→ 3’) reverse primer(5’→ 3’) 5s rRNA aagttaagcaacgtcgagccc ttagcccagttgttaccagca cf-miR-1985 cagtgccatttttatcagtcac ggtccagtttttttttttttttacag cf-miR-12 cgcagtgagtattacatcaggt ggtccagtttttttttttttttcagt cf-miR-216a cgcagtaatctcagctggt ggtccagtttttttttttttttcagaa cf-miR-216b cgcagtaatatcagctggt gtccagtttttttttttttttcagga cf-miR-67a gcagacaacctgcttgaatg ggtccagtttttttttttttttcct cf-miR-184 cagtggacggagaactga ccagtttttttttttttttgccctt cf-miR-10 gcagtaccctgtagatccga aggtccagtttttttttttttttacaa cf-novel-14 tggcactggcggaa ggtccagtttttttttttttttgtga cf-novel-2 cagacactgcgatctattgag gtccagtttttttttttttttcttagtc cf-novel-18 tgccctatccgtcagtc gtccagtttttttttttttttgcag cf-novel-31 gagctgcctgatgaagag tccagtttttttttttttttggaca 2.2.5 目的基因预测分析 John等[147]报道过的目的基因预测方法。尽管河蚬基因组和EST序列缺乏，但是有4个环境相关的基因全长(gst-pi, hsp70, cyp4 and metallothionein)可以从ncbi上获得，使用miRanda [148]和RNAhybrid [149]对miRNAs和这四个基因的3’非翻译区作了目标预测。 2.3 结果与分析 2.3.1 miRNA序列分析 我们使用河蚬外套膜，肌肉，消化腺，性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接头序列，清楚污染的和短序列后，我们获得了28,799,934条高质量的reads。这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组。得到了代表39813个序列的6194289个高质量reads（表2-2）。去除掉rRNA, tRNA, snoRNA和其他ncRNA序列，剩下的4995304 reads（代表16144个 不同的reads）被用来预测保守的和潜在的新miRNAs（表2-2）。不同类型的小RNAs的数量和比例如表2-2。 尺寸是一个重要的特征用来区分miRNAs和其他小RNA[150]。miRNAs的尺寸一般是18到24bp[151]。本次研究的小RNAs的尺寸分布如图2-1。我们发现绝大多数是22bp，占了总reads数的14.4%。同样地，在斑点叉尾（25.8%）[143]和珍珠贝中（34.48%）[29]也是22bp的最多。 图2-1 高质量reads长度分布 表2-2 河蚬中不同类型小RNAs长度分布 Small RNA Unique RNAs Percent (%) Total RNAs Percent (%) Total 39,813 100 6,194,289 100 rRNA 11,262 28.29 1,048,538 16.93 tRNA 2,124 5.33 22,289 0.36 snoRNA 19 0.05 183 0.00 other 10,264 25.78 127,975 2.07 miRNA 16,144 40.55 4,995,304 80.64 2.3.2 河蚬保守miRNAs确定 为了确定河蚬保守的miRNAs，我们将测序数据比对到在miRBase 21中的后生动物miRNAs库，允许有1到2个错配碱基[152]。总共16144个唯一的序列被比对到数据库。属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来（附录4）。此外，这些结果显示有26个保守的miRNAs超过1000测序数。miR-10测得1304866个拷贝数，是最多的，紧接着是miR-184（258355），miR-315（220094）和miR-7（144322）（附录2）。在这些保守的miRNAs中，15个只有低于100个拷贝数。miR-67a和miR-67b只被检测到1次。 2.3.3 河蚬新miRNAs的鉴定 因为河蚬基因组信息未知，所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[153]。44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs。它们二级结构的自由能从−20.10到−99.00 kcal/mol（附录3）。有28个新miRNAs被检测少于100个拷贝，15个新miRNAs少于10个拷贝。预测的5个表达最高的miRNAs的二级结构如图2-2。 图 2-2 5个表达最高的新miRNAs预测二级结构 2.3.4 河蚬miRNAs的荧光定量 为了检测河蚬潜在miRNAs的组织分布，我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平。特别地，4个新的(Novel-2, Novel-14, Novel-18 and Novel-31)和8个保守的(miR-10, miR-12, miR-67a, miR-184, miR-216a, miR-216b, miR-1985 and miR-1992)（图2-3）miRNAs被检测了表达水平。 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高，然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外，miR-1992在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]。相比较而言，一些miRNAs高度显示了组织特异性。miR-67a和miR-1985在腹足中最高，接着是外套膜，鳃和内脏团。此外，我们发现miR-12主要在腹足中表达，然后依次是内脏团，鳃和外套膜。miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少。而且，miR-184和miR-10表达水平在鳃，腹足和外套膜中几乎一样，在内脏团中明显低。而在新miRNAs中，Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富，在 鳃和内脏团表达量低。Novel-31在腹足中表达量最高，接着是外套膜和鳃，而在内脏团中非常低。Novel-2在鳃中很少表达，但在腹足外套膜和内脏团中表达高。 图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中（鳃，腹足，内脏团，外套膜）的表达水平 2.3.5 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能，我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件，这款软件允许G=U假阳性，这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]。可以用于人，老鼠，苍蝇和蠕虫的序列预测[156]。相比较而言，RNAhybrid是一款简单，快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]。这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点，能计算杂交结构自由能。 结果显示所以的环境相关基因都有相应的miRNA作用（表2-3），metallothionein基因是miR-7的目标。miR-1992，miR-2b和Novel-40可能与调控 河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻译区。然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系。 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系 表2-3 miRanda和RNAhybrid预测的河蚬miRNAs与gst-pi, hsp70, cyp4和metallothionein的关系 Genes (gene ID) miRanda RNAhybrid Conserved Novel Conserved Novel gst-pi(AY885667.1) miR-315, miR-8a, miR-8b Novel-30, Novel-38 miR-277 Novel-1*, Novel-4 hsp70(KJ461738.1) miR-1992, miR-2a, miR-2b, miR-2c Novel-40 miR-1992, miR-2b, miR-34, Novel-29, Novel-40 cyp4(JQ678818.2) miR-10, miR-1992, miR-315 Novel-30, Novel-15, Novel-23, Novel-36 miR-10, miR-1992, miR-1994, miR-263, miR-285a, miR-285b, miR-34, miR-7 Novel-1*, Novel-14, Novel-17, Novel-29, Novel-3, Novel-4 metallothionein (EF185126.1) miR-1985, miR-315, miR-7, miR-7, miR-981 Novel-20, Novel-29, Novel-31, Novel-6a, Novel-6b, Novel-8 2.4 讨论 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据，并进行了分析。发现保守的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[157]。miR-10在河蚬中是表达量最高达，文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158]，David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]。而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox 基因共表达，能调控Hox 转录本的翻译[160]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础。Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达，接下来是鳃和外套膜。Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达，仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。 河蚬新miRNAs的表达量低， 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29]，此外，25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于1000，绝大多数测序数小于100[163]。我们的结果与之前的研究是一致的[164, 165]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用。 2.5 本章小结 在本研究中，我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得28799934条高质量序列。鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs，发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系。本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。 第三章 河蚬CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.1 引言 目前，人，老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟，无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛，牡蛎，章鱼等海洋软体动物，没有淡水双壳类动物的文献报道，神经肽的毒理学研究也很少，开发河蚬典型神经肽标志物，并应用于毒理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因。 本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考，运用RACE技术，成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长，对全长序列进行了生物信息学分析，使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响，筛查了神经肽标志物。 3.2 材料与方法 3.2.1实验材料 3.2.1.1 试剂 TRIzol购自Invitrogen(USA）公司；荧光定量PCR试剂盒、琼脂糖、M-MLV试剂盒、Oligo-(dT） 18、DNase I和dNTP购自Promega（USA）公司；100 bp 和 2000 bp ladder购自天根生物（北京，中国）公司；SMART RACE cDNA amplification kit 购自Clontech(USA）公司；TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit, pMD20-T vector 和E.coli JM109 感受态细胞购自TaKaRa(Dalian, China）公司； 三氯甲烷，异丙醇和无水乙醇都是国产分析纯。 3.2.1.2实验仪器 Centrifuge 5804R离心机(eppendorf, USA） PowePac Basic电泳仪(BIO-RAD, USA） Gel Doc XR+凝胶成像仪(BIO-RAD, USA） 梯度热循环仪（Veriti thermal cycle system）（Life Technologies，USA） Multiskan GO 酶标仪（Thermo Scientific，USA） 荧光定量 PCR 仪7500 Real-Time PCR system（Life Technologies，USA） 3.2.1.3统计分析与绘图软件 SPSS16.0 软件，Origin8.0软件 3.2.2河蚬的实验室养殖 河蚬购自洪泽湖，在盱眙县老子山镇洪泽湖码头采集，壳长在1-3cm 左右，年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养。采用流水养殖，建立一套恒温的流水系统进行养殖，选用水泥池流水循环系统养殖河蚬，以水泵提供流水动力，建有过滤池和养殖池，水经过水泵从过滤池传送到养殖池，再流回过滤池进行过滤。池底铺粒径为0.5 mm左右的细沙，所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水，室内温度使用空调控制，水温保持在20±1ºC，水质硬度在250mg/L以下, 光照周期为12h：12h，饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻，或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料。河蚬实验室养殖规范见附录1。 3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步骤： 河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法，在无菌和无RNA酶的超净工作台进行，具体操作步骤如下： (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5 ml EP管，迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液，然后用电动棒碾磨均匀，接着加入冰预冷的800μL Trizol液，注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%，室温放置5min，使其充分裂解。 (2)以每1mlTrizol液加入0.2ml 的比例加入冰预冷的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15 秒，室温放置3 min，然后放入离心机，4℃，12000转，离心15min，吸取上层水相，尽量不要将沉淀吸入，移至另一1.5mLEP管中。 (3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀，室温放置10min。 (4)12000 g，4°C，离心10 min，弃上清，此时RNA沉于管底。 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇，用手轻轻上下翻转约50次，用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g，4°C下离心5min，尽量弃上清。 (7)室温瞭干，注意不要干燥过分，然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时，样品纯度符合要求，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA （1）用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染。 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL） RNA 16μL DNaseⅠ 2 μL 10×DNaseⅠ Buffer 2μL Total volume 20 μL （2涡旋混匀后，37°C 水浴 30min。 （3）加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL，混匀，瞬时离心，65°C 反应 10min。 （4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量，使用Promega
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