基本介绍

2005年底，454 生命科学公司推出454测序技术，这技术是基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统, 是二代测序发展技术发展的先驱。2007年又推出了性能更优的第二代基因组测序系统——Genome Sequencer FLX System。2008年10月，454推出了全新的GS FLX Titanium系列试剂和软件，让GS FLX的通量一下子提高了5倍，准确性和读长也进一步提升。

在2010年先后与IBM和DNA Electronics结成联盟，并在2012年初和年底，Roche两次向Illumina发起敌意收购，最终给出了67亿美元的报价，但遭到拒绝。然而，遗憾的是，由于各种原因，罗氏公司已宣布将于2016年年底终止454高通量测序相关的业务，包括测序平台服务和相关试剂的提供等等。

如今，罗氏主要的测序产业主要与Pacific Biosciences合作开发以PacBio SMRT技术为基础的诊断产品。 

Roche 454 GS FLX+ 测序平台

基本特点

Roche 454 GS FLX+ 测序平台是罗氏旗下的454生命科学推出的最新升级版测序仪，该仪器的最大读长能够达到1000bp，测序准确性高达99.997%，达到了与Sanger相当的长度与准确性，并降低了测序成本，从而集一代sanger测序读长及质量优势与二代测序高通量特点于一身。

GS FLX & GS FLX+数据产出

	GS FLX+	GS FLX
读长	~1,000bp	~600bp
平均读长	700bp	450bp
测序通量	>700M**	450M-650M
测序长度分布	85%以上的reads>500bp ; 45%以上的reads>700bp	85%以上的reads>300bp ; 20%以上的reads>500bp
每个Run reads数	~ 1,000,000	~ 1,000,000
准确度	99.997%	99.995%
运行时间	23h	10h
样本要求	DNA或cDNA	DNA、cDNA或PCR产物

测序原理：焦磷酸测序-依靠生物发光对DNA测序

在多种酶的协同作用下，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在各种酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。

技术特点：

• 速度快，一个测序反应耗时10个小时，获得4-6亿个碱基对。比传统的Sanger测序的方法快100倍；

• 读长长，单个序列的读长更长，平均可达到450个碱基左右；

• 通量高，每个反应可以得到超过100万个序列读长，成本大大降低；

• 准确度高，读长超过400bp时，单一读长的准确性可以超过99%；

• 一致性好，测序结果一致性超过99.99%；

• 可以进行Pair－End测序研究；

• 简便高效，不需要进行建库、克隆挑取、质粒提取等工作，一个人可以在一天内完成一个微生物物种的测序工作。

测序流程

具体测序流程可以总结为下图：

相关应用

截至 2008 年 9 月，利用454 GS FLX+ 平台已经发表了 250 多篇高质量的 paper。与其他新一代测序平台相比，454 平台的突出优势是读长。目前 GS FLX 系统的序列读长已超过 400 bp。虽然 454 平台的测序成本比其他平台要高很多，不过对于那些需要长读长的应用，如 从头拼接和宏基因组学，它仍是最理想的选择。

454 GS FLX+ 主要应用的领域包括：微生物群落多样性分析（16s, 18s, ITS）、复杂环境样品的宏基因组学研究、微生物基因组的de novo测序、转录组测序研究，此外还可应用于外显子测序、目标区域捕获、病原菌检测等研究。

下面是一个可应用相关领域的总结： 

References

1. http://www.y-lp.com/pages/Article.aspx?id=6351768989120952478

2. http://blog.sciencenet.cn/home.php?mod=space&uid=201103&do=blog&id=312599

3. http://www.macrogencn.com/newsitem/275872207

4. http://www.genomics.cn/navigation/show_navigation?nid=502

5. http://blog.sina.com.cn/s/blog_80d2d9fd0101690h.html

本文作者：lakeseafly

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