Ion Torrent是新一代的测序技术之一,2011年该技术在Nature上被报道( “An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing." Nature 2011 (475:348–352) )。 Ion Torrent由于硬件设备无需光学检测和扫描系统,并且使用天然核苷酸和聚合酶、无需焦磷酸酶化学级联,无需标记荧光染料和化学发光的配套试剂,因此测序成本低,其应用范围涵盖Sanger方法和已有高通量测序技术的应用,如基因组DNA序列测定(微生物基因组测序、线粒体测序、靶向测序)、DNA扩增子测序等。
概念理解
Ion Torrent是新一代的测序技术之一,2011年该技术在Nature上被报道( “An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing." Nature 2011 (475:348–352) )。 Ion Torrent由于硬件设备无需光学检测和扫描系统,并且使用天然核苷酸和聚合酶、无需焦磷酸酶化学级联,无需标记荧光染料和化学发光的配套试剂,因此测序成本低,其应用范围涵盖Sanger方法和已有高通量测序技术的应用,如基因组DNA序列测定(微生物基因组测序、线粒体测序、靶向测序)、DNA扩增子测序等。
它的核心技术是使用半导体技术在化学和数字信息之间建立直接的联系。 在半导体芯片的微孔中的微球上固定DNA链,随后依次掺入ACGT。随着每个碱基的掺入,释放出氢离子, 反应池中的pH发生改变,位于池下的离子感受器感 受到信号,把化学信号直接转化为数字信号,从而读出DNA序列 。
详细过程
Ion Torrent测序芯片是一个半导体芯片,上面做了数以百万、千万计的小孔。它每个小孔的即是测序微珠的容器,又同时是一个微型的PH计。每个小孔正好可以容纳一个测序微珠。 在测序过程当中,就是通过测量、并记录每个小孔中所发生的PH值的变化,来测出DNA序列的。 每个芯片都会有一个进口,还会有一个出口,是走液流用的。在测序珠子上机的时候,就从进口把珠子的混悬液注入到芯片上,然后再把这个芯片离心一下。离心的作用,是更好地把珠子卡到小孔中去。
Ion Torrent的测序原理是:每个dNTP分子都有3个磷酸基团,当dNTP被聚合酶结合到DNA链上 时,会掉下来一个分子的焦磷酸,1个焦磷酸分子会被酶再进一步分解成2个磷酸分子。这样在测序的微环境中,就会多出两个酸性分子。一个珠子上有几千、几百条DNA链,每次发生聚合反应,就会多出几千、几百个酸分子。这样,这个为缓解的PH值就会短暂地下降。这时候,Ion Torrent芯片中,每一个小孔中的PH电极,就测量这个小孔中的PH值变化。并且把测量到的值传给计算机。
把分别含有A、C、G、T四种dNTP的溶液,分别地、依次地流过芯片表面。举例来说流入的是dCTP溶液,而模板上正好有一个G碱基。就会发生聚合反应,病产生电压变化,而且会被记录下来。如果流入的溶液与模板上的碱基不匹配,就不会发生聚合反应。也就没有电压变化,也就不会有碱基被记录下来。
如果正好有2个异样的碱基相邻,一次就正好有两个碱基被聚合到DNA链上,电压电压变化值也就会加倍。序列中就会有2个新的碱基被记录下来。
在测序的序列安排上,最前面的4个碱基叫Keysequence,分别是A、C、G、T,因为每个珠子上长多少个DNA链,它的变化范围是很大的。所以用Key Sequence的A、C、G、T四个碱基所测到的PH值变化的强度来确定这个珠子的信号强度。 有了标准的信号强度之后,后面测到的信号后河这4个信号强度做对比。如果是一倍的强度,我们就知道有一个碱基。如果有2倍的碱基,就知道串联了个相同的碱基。依次类推。
参考视频: https://v.qq.com/x/page/v01754s6r82.html\
技术特点
简单:基于半导体技术测序原理,不用荧光、化学发光和酶级联反应;消耗样本少;
快速:从文库构建到数据产出只需2天,上机测序只需2~3小时;
灵活:可满足不同通量的测序需求: 314 TMChip(~10Mb/run),316 TMChip(~100Mb/run),318 TMChip(~1Gb/run)
准确性:99.97%
Homopolymer: 但是 Ion Torrent测序平台一直有一个Homopolymer的问题。所谓Homopolymer问题,就是测序仪在测到一连串相同的碱基时,就读不准到底有几个碱基。比如说,有一串5个A,测序仪在读到这里的时侯,读到一个强的A信号,但是仪器在判断,这个信号到底是5个A,还是4个A、或者是6个A的时侯,有可能会判断错误。这就是我们所说的Homopolymer错误。
应用
Ion PGM的芯片决定了待测样本的通量,通常根据不同的需要选择不同的芯片,最高通量在1G左右。因此, PGM在体细胞突变测序、 De novo测序、小RNA和基因表达研究、 ChIP-seq、农业SNP应用等方面有着不少的应用范围。
上半年发表在 Mol Ther Nucleic Acids的 Inhibition of EGF Uptake by Nephrotoxic Antisense Drugs In Vitro and Implications for Preclinical Safety Profiling就使用了这个平台的数据, GSE83392,有兴趣可深入探究。
参考:
Sequencing in the Dark: Analysis of Life Technologies’ Ion Torrent sequencing platform points to significance of photon-free technology. March 01, 2012 https://www.genengnews.com/gen-exclusives/sequencing-in-the-dark/77899563
thinkanddo《7种测序平台》 http://www.cnblogs.com/think-and-do/p/6638157.html