在开始数据分析之前，一个很重要的工作就是对数据进行评估，数据质量的好坏会直接影响到数据分析的结果。
当我们从测序公司拿到原始数据以后，如何评估测序质量呢？今天主要给大家介绍一款简单实用的工具FastQC。
FastQC的使用
1.安装简介
官网主页：https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
该软件支持多个系统平台（Windows、Linux以及MacOS），它是一款Java软件，使用之前得保证自己的系统拥有Java Runtime Environment（JRE），这里介绍的是它在Linux系统中的安装。
安装方法1：wget/axel命令下载安装包，unzip命令解压，chmod u+x 命令修改为可执行权限。
安装方法2：conda命令直接安装，使用该命令需要先安装Bioconda。
conda install -c bioconda fastqc=0.11.5
2.命令说明
fastqc -o output dir -f fastq|bam|sam seqfile1 .. seqfileN
①-o 用来指定输出文件的目录，fastq是不能新建目录的。输出的结果是.zip文件，默认自动解压缩，如果加上--noextract参数则不解压缩。
②-f 用来强制指定输入文件格式，默认会自动检测。
③-c用来指定一个contaminant文件，fastqc会把overrepresented sequences去这个contaminant文件里搜索。contaminant文件的格式是"Name\tSequences"，#开头的行是注释。
④-q 会进入沉默模式，即不出现下面的提示：
Started analysis of target.fqApprox 5% complete for target.fqApprox 10% complete for target.fq
注意：-o参数用于指定FastQC报告的输出目录，这个目录需要事先创建好，如果不指定特定的目录，那么FastQC的结果会默认输出到测序文件的同一个目录下。它输出结果只有两个，一个html和一个.zip压缩包。
3.报告解读
我们可以直接通过浏览器打开html，就可以看到FastQC给出的所有结果，zip压缩包解压后，从中我们也可以在对应的目录下找到所有的QC图表和Summary数据。另外，FastQC支持同时输入多个fq文件（或者以通配符的形式输入fq），当我们的fq文件比较多时，这种用法会比较方便。
这里选用官网的Bad Illumina Data进行说明，报告包括如下内容：
左边是12项指标的概要，右边是各项指标对应的结果，每项结果的颜色包括绿色√（合格），黄色！（警告）和红色×（不合格）。右上角是报告生成的日期和对应的文件名称。
12项指标的官方解读
http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Help/3%20Analysis%20Modules/
Basic Statistics
Encoding指测序平台的版本和相应的编码版本号，可推测是Phred 64 质量分数的编码方式。
Total Sequences指输入文本的reads的数量。
Sequence length指测序的长度
%GC 是我们需要重点关注的一个指标，这个值表示的是全部序列中的GC含量，这个数值一般具有物种特异性，比如人类细胞就是42%左右。
Per base sequence quality
用箱式图的方式展示数据质量，图中每1个位置，都是该位置的所有序列的测序质量的一个统计。横轴表示测序序列的位置；纵轴是质量得分，Q =-10*log10(p)，p为测错的概率。所以一条reads某位置出错概率0.01时，其quality就是20。红色表示中位数，黄色是25%-75%区间，触须是10%-90%区间，蓝线是各个位置的平均值的连线。
若任一位置的下四分位数低于10或中位数低于25，报"黄色!"；若任一位置的下四分位数低于5或中位数低于20，报"红色×"。一般要求此图中，所有位置的10%分位数大于20,也就是常说的Q20过滤。由此可知这个测序结果质量很差，报"红色×"。
Per tile sequence quality
这一模块是检查在测序平台上，reads中每一个碱基位置在不同的测序小孔之间的偏离度，偏离度越高，碱基质量越差。横轴表示测序序列的位置；纵轴表示测序小孔。蓝色表示低于平均偏离度，越红则说明偏离平均质量方差越多，也就是说质量越差。如果出现质量问题可能是短暂的，如有气泡产生，也可能是长期的，如在某一小孔中存在杂质。
偏离度小于平均值2以上报"黄色!"，偏离度小于平均值5以上报"红色×"。本图结果较差，故报"红色×"。
Per sequence quality scores
每条reads的quality的均值的分布：为了检测一部分质量特别差的reads，如果有，则会在图上出现多个峰，如在测序仪边缘的reads。横轴表示质量分数，代表不同Phred值对应了多少的reads；纵轴表示reads数目。
当峰值小于27（错误率0.2%）时警报，当峰值小于20（错误率1%）时不合格。本图测序结果的峰值主要集中在高分（31），证明测序质量良好。
Per base sequence content
对所有reads的每一个位置，统计ATCG四种碱基（正常情况）的分布： 正常情况下四种碱基的出现频率应该是接近的，而且没有位置差异。因此好的样本中四条线应该平行且接近。当部分位置碱基的比例出现bias时，即四条线在某些位置纷乱交织，往往提示我们有overrepresented sequence的污染。当所有位置的碱基比例一致的表现出bias时，即四条线平行但分开，往往代表文库有bias (建库过程或本身特点)，或者是测序中的系统误差。横轴表示测序序列的位置；纵轴表示百分比。当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过10%，报"黄色!"；当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过20%，报"红色×"。本图中有位置出现A/T比例与G/C比例相差超过10%，所以报"黄色!"。
Per sequence GC content
统计reads的平均GC含量的分布：红色曲线是实际的测序GC含量分布图，而蓝色曲线则是理论分布（正态分布，不过均值不一定都是50%，而是由平均GC含量推断的）。如果红色曲线形状存在比较大的偏差，往往是由于文库的污染造成的。红色曲线越平滑越好，越接近蓝色曲线越好。形状接近正态但偏离理论分布的情况提示我们可能有系统偏差。横轴表示平均GC含量；纵轴表示测序文件每个序列的全长。
偏离理论分布的reads超过15%时发出警报，超过30%时报不合格。
Per base N Content
对所有reads的每个位置，统计N的比率：当测序仪器不能辨别某条reads的某个位置到底是什么碱基时，就会产生"N"。横轴表示测序序列的位置；纵轴表示百分比。正常情况下N的比例是很小的，当纵轴在0%-100%的范围内也能看到"鼓包"时，说明测序系统出了问题。
当任意位置的N的比例超过5%，报"黄色!"；当任意位置的N的比例超过20%，报"红色×"。
Sequence Length Distribution
reads长度的分布：每次测序仪测出来的长度在理论上应该是完全相等的，但是总会有一些偏差，如此图中，40bp是主要的，但是还是有少量的39和41bp的长度，不过数量比较少，不影响后续分析。当测序的长度有很大不同时，则表明测序仪在此次测序过程中产生的数据不可信，但对于某些测序平台，具有不同的read长度是完全正常的。
当reads长度不一致时警告，当有长度为0的read时不合格。
Sequences Duplicate Levels
统计序列完全一样的reads的频率：横轴表示reads重复的次数；纵轴表示重复次数对应的reads占不重复的reads的比例。测序深度越高，越容易产生一定程度的duplication，这是正常的现象，但如果duplication的程度很高，那么表明存在富集的偏好（enrichment bias）（比如：测序过程中的PCR重复，转录组测序中某些基因表达量高），序列重复比例越高，则表明实际有用的序列越少。图中有蓝红两条线，蓝色线表示的是文件中所有的序列中duplicate程度的分布，红色线表示的是去冗余之后的序列，含量表示的在全部序列都考虑时不同冗余程度的序列所占的比例。
重复reads占总数的比例大于20%时报"黄色!"，大于50%时报"红色×"。
Overrepresented sequences
如果有某个序列大量出现，就叫做over-represented。fastqc的标准是占全部reads的0.1%以上。和上面的duplicate analysis一样，为了计算方便，只取了fq数据的前200,000条reads进行统计，所以有可能over-represented reads不在里面。而且大于75bp的reads也是只取50bp。
当发现超过总reads数0.1%的reads时报"黄色!"，当发现超过总reads数1%的reads时报"红色×"。
Adapter Content
此图衡量的是序列中两端adapter的情况，如果在fastqc分析的时候-a（指定含adapters序列文件）选项没有内容，则默认使用图例中的通用adapter序列进行统计。
含有adapter超过所有reads的5%的报"黄色!"，超过10%报"红色×"。
Kmer Content
如果某k个bp的短序列在reads中大量出现，其频率高于统计期望的话，fastqc将其记为over-represented k-mer。默认的k = 5，可以用-k --kmers选项来调节，范围是2-10。出现频率总体上3倍于期望或是在某位置上5倍于期望的k-mer被认为是over-represented。fastqc除了列出所有over-represented k-mers，还会把前6个的per base distribution画出来。
当有出现频率总体上3倍于期望或是在某位置上5倍于期望的k-mer时，报"黄色!"；当有出现频率在某位置上10倍于期望的k-mer时报"红色×"。本图所显示的结果来自于表格中前六个序列。
文末福利：Fastqc视频学习链接（，这里推荐两个不同的视频，英语视频：http://v.youku.com/v_show/id_XNTQ2NjA4Mzc2.html；中文视频：https://v.qq.com/x/page/c0359foiqg1.html?ptag=qqbrowser），点击阅读原文即可观看中文视频进行学习。
批量显示QC结果：MultiQC
官网主页：http://multiqc.info
功能：把多个测序结果的qc结果整合成一个报告。支持fastqc、trimmomatic、bowtie、STAR等多种软件结果的整合。
安装：使用conda命令安装，需要先安装Anaconda。
conda install -c bioconda multiqc # install multiqcmultiqc . #Run
该软件能批量显示QC结果，限于本文的篇幅，这里不做过多介绍，详情请看参考链接。
补充：
1、数据质控是一个综合的评价标准，其中主要指标为碱基质量与含量分布，如果这两个指标合格了，后面大部分指标都可以通过。如果这两项不合格，其余都会受到影响。
1、数据质控是一个综合的评价标准，其中主要指标为碱基质量与含量分布，如果这两个指标合格了，后面大部分指标都可以通过。如果这两项不合格，其余都会受到影响。
2、其中一些指标并不适合所有数据，例如DNA数据与RNA测序数据之间的差异等，要根据具体数据类型，具体分析。
3.一般顺序是先查看数据质量而后对所的序列利用runtrimmomatic等软件对序列进行处理，在一般我们获得的数据中，质控一般做的还是比较到位的。
参考链接
1.用FastQC检查二代测序原始数据的质量 （http://yanshouyu.blog.163.com/blog/static/214283182201302835744453/）
2.Illumina测序数据的质量控制（QC）-1（https://zhuanlan.zhihu.com/p/24608131?group_id=871001548837228544）
3.批量显示QC结果的利器（http://fbb84b26.wiz03.com/share/s/3XK4IC0cm4CL22pU-r1HPcQQ1iRTvV2GwkwL2AaxYi2fXHP7）
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