非靶向代谢组学数据分析连载（第零篇引子）
（之前这篇已经发过了，但是题目错误，中间的链接也可能不可用了，此次我更新了链接和修改了题目，明日开始连载：多多捧场哦）
时间慢慢过去了，答应过的事情哭着也要做完，代谢组分析的全套，这次我来送给大家：
目前对于使用代谢组发文的数量是越来越多了，真的是一目了然啊，2018年过半，文章的数量已经和2017年差不多了，势头很猛，早做打算不至于落的被动：
本次我带给大家的是非靶向代谢组学的数据，GC-MS比较老，测的人也比较多，数据库会比较全，当然数据量很大，处理起来会费劲，之前给大家分享的16s扩增子数据，otu.table里面OTU的数量是几千到几万不等，而非靶向代谢组学的数据往往是在几百到几千个峰，这里引用MetaboAnalyst的ppt为大家做一个做一个组学的数据量的简单比较：
Genomics | DNA sequence | 100,000 - 1,000,000 |
Transcriptomics | Gene expression | 10,000 - 100,000 |
Proteomics | Protein expression/ interaction | 1,000 – 10,000 |
Metabolomics | Compound concentration | 100 – 1,000 |
我要分享给大家的GC-TOF-MS非靶向代谢组学的数据的处理过程：
这里我将直接向大家展示在公司测个的数据，也就是在这些操作完成后的数据（这些处理相比之后的数据分析可能并不重要，所以我可能在最后进行分享，或者就不分享了）：
使用ChromaTOF软件（V 4.3x，LECO）对质谱数据进行了峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐等分析。对物质定性工作中，使用了LECO-FiehnRtx5数据库，包括质谱匹配及保留时间指数匹配。
这份数据我在biotree测得，测定于2017年，分析是在今年上半年完成了，但是最为讲解使用数据，我将数据进行了一改动，是目前很新的一份sample供大家学习，打开是这样的；
这里我展示两组的数据，这批数据共展示了708个峰值，这里面的数值表示的是分面积值，第一行id表示的是化合物名称，在这一行这里主要有三种类型，第一种就是化合物的英文名称，第二中就是unknow表示完全不清楚了，第三种是Analyte是似乎有一定的概率匹配上数据库的，但是和数据库中相比相似度不够大，不能确定是什么物质，缺失值表明未能测出来；
另外一份文件就是mapping，这是我处理16s数据延续下来的习惯，其实这样就不必在R中构造一个分组变量了，虽然我们这批数据量很小，对于新手来讲，可能更容易入手；
刚开始我们就需要这两份文件，在之后的分析过程中可能我会持续上传一些文件，还有一些需要使用的文件，我都会及时给出链接，方便大家下载使用；当然相应的R脚本我也会持续放给大家，都是经过多次测试的脚本，大家将文件全部下载下来，使用Rstudio打开脚本，只需要将工作路径更换，即可重现结果；
下面是原始数据的百度网盘链接：
链接：https://pan.baidu.com/s/1iuFm6p_j-AgY4nUSyS1p3w 密码：23r7
如果失效，请及时留言
下面我首先来讲这份数据的产生过程，大家在处理的过程中会更清楚一些：
经历过以上过程，我们就得到了一张表格：
这份处理流程是我在biotree测定，也就是这份数据的处理流程：
代谢物提取
1. 转移样本于2mL EP管中，加入1mL提取液（甲醇水体积比=3:1），再加入10μL
核糖醇，涡旋30s；
2. 加入瓷珠，45Hz研磨仪处理4min，超声5min（冰水浴）；
3. 将样本4℃离心，13000rpm离心15min；
4. 小心移取0.75mL上清液于2mL进样瓶（甲烷硅基化的）中；
5. 在真空浓缩器中干燥提取物；
6. 向干燥后的代谢物加入40μL甲氧胺盐试剂（甲氧胺盐酸盐，溶于吡啶20mg/mL），
轻轻混匀后，放入烘箱中80℃孵育30min；
7. 向每个样品中加入50μLBSTFA（含有1% TMCS, v/v），将混合物70℃孵育1.5h；
8. 随机顺序上机检测。
上机检测
Agilent 7890气相色谱-飞行时间质谱联用仪配有Agilent DB-5MS毛细管柱（30m×250μm×0.25μm, J&WScientific, Folsom, CA, USA），GC-TOF-MS具体分析条件如下：
表4. 仪器参数
项目 | 参数 |
进样量（Sample Volume） | 1μL |
分流模式（Front Inlet Mode） | Splitless Mode |
隔垫吹扫流速（Front Inlet Septum Purge Flow） | 3mL min−1 |
载气（Carrier Gas） | Helium |
色谱柱（Column） | DB-5MS（30m×250μm×0.25μm） |
柱流速（Column Flow） | 1mL min−1 |
柱箱升温程序（Oven Temperature Ramp） | 80°C hold on 1min, raised to 290°C at a rate of 10°C min−1, hold on 12min |
前进样口温度（Front Injection Temperature） | 280°C |
传输线温度（Transfer Line Temperature） | 295°C |
离子源温度（Ion Source Temperature） | 220°C |
电离电压（Electron Energy） | -70eV |
质量范围（Mass Range） | m/z:50-600 |
扫描速率（Acquisition Rate） | 10 spectra per second |
溶剂延迟（Solvent Delay） | 8.06min |
数据处理
使用ChromaTOF软件（V 4.3x，LECO）对质谱数据进行了峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐等分析。对物质定性工作中，使用了LECO-FiehnRtx5数据库，包括质谱匹配及保留时间指数匹配。
在本次实验中共检出了 708 个峰，详细情况请参见数据附表。这里有十二个样品，我们分析只做六个
质量控制
1、过程质控
样品的检测要持续很长时间，尤其是当样本量很大的时候。在检测过程中实时地监控仪器稳定性、信号是否正常就十分重要。及时发现异常，尽早将问题排除，以保证最终采集数据的质量。
① 内标响应情况
由图3可以看到内标核糖醇在样品中的保留时间和峰面积稳定性很好。说明仪器数据采集稳定性很好。
图3. 内标核糖醇的EIC图
① 物质残留情况
通过对空白样品的检测可以考察在检测过程中物质残留情况。从图4中可以看到空白样品中无显著峰检出，说明物质残留控制的很好。不存在样品间的交叉污染。
图4. 空白样品TIC图
以上过程到最后我们得到一张表，都是由公司做的，如果要公司做后续的分析，会更贵，相比之下，我们研究生劳动力这么不值钱，我们自己倒确实会省钱，为了你的老板，赶快学技术吧！
最后我们欣赏一下代谢通路美图吧！