Thermotoga petrophila普鲁兰酶基因的异源表达与酶学性质分析
《河南农业大学学报》2018年第52卷第3期刊载了河南农业大学邢岩，邱爽，聂慧慧，孙利鹏，邱立友和王明道的论文——“Thermotoga petrophila普鲁兰酶基因的异源表达与酶学性质分析”。该研究由科技部“十二五”农村领域科技计划项目（2013AA102101-2）以及河南省重点科技攻关项目（142102110086）资助。责任编辑曾庆东。
普鲁兰酶是一种重要的淀粉脱支酶。普鲁兰酶根据作用位点的不同分为Ⅰ型普鲁兰酶和Ⅱ型普鲁兰酶。根据反应温度的不同分为低温酶、中温酶、嗜热酶和超嗜热酶。其中嗜热普鲁兰酶是指作用温度在55~80 ℃的普鲁兰酶，超嗜热普鲁兰酶则是指作用温度在80 ℃以上的普鲁兰酶。普鲁兰酶在工业上的应用非常广泛，但大部分热稳定性和比酶活性不高，或是不能适应酸性高温的作用环境。因此，寻找并获得高比酶活性并耐酸耐热的普鲁兰酶尤为重要。
目前，对于新普鲁兰酶的发现主要借助于传统的筛菌，既耗时又费力。而通过生物信息学筛选，可以从菌种保藏中心获得含有该嗜热酶基因的微生物。另外，借助异源表达系统可以实现微生物酶的高效表达。本研究所筛选的Thermotoga petrophila是从日本新舄县的油田中分离出来的一株严格厌氧的超嗜热菌，其最佳生长温度为80 ℃，基因组全长为1 823 kb，该菌基因组上含有普鲁兰酶基因，且对应氨基酸序列为普鲁兰酶。因此，以德国菌种保藏中心购买的基因组为模板，将该普鲁兰酶基因异源表达后进行酶学性质分析，通过利用生物信息学方法，获得酶学性质优良的普鲁兰酶，并为新酶的开发提供了思路。
本研究使用的pET21a质粒、大肠杆菌Rosetta（DE3）和DH5α菌株均为河南农业大学酶工程重点实验室所保藏。Thermotoga petrophila（DSM13995）的基因组购自德国菌种保藏中心DSMZ。
本研究从德国菌种保藏中心购买的基因组作为出发材料，克隆出普鲁兰酶基因TP-pulA；利用二步PCR方法构建了含有该嗜热普鲁兰酶基因的载体pET21a-TP-pulA；将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中测定其酶学性质，包括最适pH值、最适温度、半衰期 、不同化学试剂对酶活性的影响以及酶促动力学参数。
研究结果表明：TP-pulA为Ⅰ型普鲁兰酶；最适pH值为6.4；最适温度是85 ℃；半衰期为26.28 h；Na+、K+、Ca2+、Mg2+ 对其酶活性有明显的促进作用；Mn2+、Co2+、AL3+、Fe3+、SDS及EDTA对酶活性有不同程度的抑制作用；Km、Vmax、Kcat 及Kcat/Km 值分别为0.72 g·L-1、0.004 9 mmol·L-1·s-1、154.63 s-1、214.76 L·g-1·s-1。
本研究中采用的生物信息学方法比传统的筛菌方法简单方便耗时短，且获得的嗜热普鲁兰酶的热稳定性好、催化效率高、对普鲁兰糖有较强的底物亲和能力，具有良好的应用前景。
该普鲁兰酶属于超嗜热普鲁兰酶。与低温和中温普鲁兰酶相比，该酶具有较高的热稳定性，便于运输和储藏，降低了成本；且该酶在高温下能保持较高的活性，为其在糖化反应中的应用奠定了基础。
作者简介：
王明道，河南农业大学生命科学学院副教授，博士，硕士生导师。主要从事地黄、芝麻、烟草等作物的连作障碍及化感作用等农业生物技术方向研究，以及微生物酶的研究与开发，新的微生物酶资源发现、改造天然酶性质、拓宽酶的应用领域、促进酶的产业化生产等酶工程方向研究。承担科研项目各类课题十余项，发表相关论文20余篇。
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