精彩回顾 | 冻存样本在单细胞领域的应用价值
于 5 月 10 日在线举办的【唤醒沉睡的样本库】系列讲座第二期已圆满结束。本次讲座中联川生物的蒋建国老师就“冻存样本在单细胞领域的应用价值”讲题进行了精彩分享。直播期间大家提问非常踊跃，为了让更多的观众从精彩问答中受益，我们特意准备了问答环节的全程回顾。
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Q1
保存多久的冻存样本可以用于单细胞核测
序？
推荐三个月以内的样本，RNA 降解概率较小。一般按照这样的时间段去考虑（-80 度冰箱保存）：3 个月以内，3-6 个月，6 个月 -1 年，一年到两年，两年以上。随着时间段的推移，实验的可实现性越低。需要考量 RNA 降解程度，推荐采用安捷伦 2100 生物质检仪检测 total RNA 的降解情况（RIN>6 有较好的实验表现）。
Q2
单细胞核测序现在可以做免疫组分析吗？
不建议。单细胞免疫组包含 mRNA（polyA 转录本）、TCR（T 细胞表面受体）、BCR（B 细胞表面受体）的检测，细胞核的方式对于 mRNA 的捕获理论上是可行的。但是 VDJ profile 主要是细胞质中 TCR、BCR 成熟的转录本序列，因此细胞核测序无法准确抓取 TCR、BCR 转录本。
Q3
保存的样本，没有用液氮速冻，直接 -80
保存的，还可以用于单细胞测序吗？
理论上组织离体以后，立刻液氮速冻，相当于把组织里面细胞固定住。固定以后，对于细胞内 RNA 扰动，以及 RNA 降解，都起到保护作用。如果没有液氮速冻也是有概率不降解的，这时候需要采用安捷伦 2100 生物质检仪进行 total RNA 的质检，如果 RNA 完整度较好，这时候对于单细胞核测序是有可行性的。
Q4
对于肾脏样本，若是想获得更多的细胞类
型，冷解离和抽核两种方式哪种更好呢？
冷解离是在低温环境（4 摄氏度）的解酶反应，实际上对于细胞类型的分离效率，温度越低，分离效率越差。实际测试也发现冷解离解离时间是偏长的，具体解离多长时间，要根据具体样本去做摸索。所以目的是想要拿到更多的细胞类型，推荐还是用抽核这个方式，它对于细胞类型的获取更容易。
Q5
冻存样本用于单细胞研究前期有哪些评判
指标，可以指导后续数据的评判？
第一个最直接是通过安捷伦 2100 质检仪去看 total RNA 有无降解。如 RNA 完整度较好证明样本是可以考虑去开展单细胞核测序。另外对于抽核之后的细胞核完整度，细胞核悬液的背景是否纯净等，也是重要的指标。其次一个非常重要的指标是做完单细胞标记反转录成 cDNA，根据 cDNA 的浓度和峰形就能大概能评判后续数据质量。
Q6
同样得脑组织悬液和抽核获得的细胞类
型和占比上有啥差异？
联川之前做过测试，拿小鼠脑皮层的组织，我们用细胞悬液的方式拿到的主要是一些胶质类或者是免疫类细胞，主要因为神经细胞比较偏大，无法进行标记，解离出来的大的细胞会过细胞筛过滤掉。对于抽核，本质上是无偏差捕获细胞，它更能够反映组织真实的细胞比例，抽核的方式神经元占比会比较高，其次是一些实质细胞（比如内皮、上皮细胞）和一些占比较少的胶质细胞。
Q7
单细胞数据结果有哪些质检指标?
一般最先看是捕获的细胞数量，另外比较重要的指标是单个细胞里基因的检出率，一般会以基因中位数这个指标去评判。其他如：检测出来 total 基因数目，高质量细胞的占比，饱和度等，这些都是可以作为数据评判的指标。但需要强调的是，对于一些数据评判不要唯标准论，一些情况下可以根据样本特殊情况，可以对指标进行放宽或调整。
Q8
细胞核相较于细胞的方式开展单细胞，基
因中位数要低很多，这个是什么情况？
本次讲座中的结论告诉我们，细胞核与细胞质中检测的基因数量（或者说基因种类）大致是一样的！但是核内的基因丰度确实可能低于整个细胞内的。如果最后数据体现核的基因检测率或者基因总数偏低，有可能的原因是，在分析上一些低丰度的基因可能给过滤掉了，或这种 GEM（单个细胞/核 beads 反应体系）产生的数据没有把它当做细胞数据保留下来。在这种情况下，可能会看到核单细胞测序的基因检出率偏低。
Q9
测序过程中批次差异对结果影响大吗？
可否通过数据处理-去批次效应基本消
除影响？需要把不同时间收集的样本放
在同一批上机吗？
现实中确实有很多这样的情况，尤其一些临床样本，一次手术或者活检只能取一两个样本。那是直接开展？还是等到其他样本全取完？大部分的建议是取一例做一例。有两方面的因素，一方面联川的实验、测序分析，是相对流程化，标准化的过程。对于单个样本的系统外误差是可以消除的。但确实没法避免出现批次差别，后续也可以通过分析软件做批次效应去除。
建议：假设样本短期内间隔比较大，可以单次先做。如果间隔比较小，可以通过一些保存方法，把样本集中到一起再做。这两种方式都是可以考虑的。
Q10
新鲜取样的样本是否也需要用单细胞核
的方式进行研究？怎么选择？
对于新鲜样本，理论上可以默认按照细胞悬液方式做。但是因为细胞核有它的应用场景。
比如含有大细胞的组织，比如考虑到酶解容易造成基因扰动，还有一些难解离的样本，可以考虑用细胞核测序的方式。
Q11
石蜡样本可以开展单细胞核测序吗？
目前是很少有这种案例，不建议开展石蜡样本的单细胞核测序。因为石蜡样本的 RNA 降解度是比较高的，现在的单细胞捕获原理是基于 polyA 抓取的方式，因此对于降解程度高的样本基因的捕获准确度是有很大的影响。如果有靶向方式，比如设计一些基因库特定的锚定引物，那是可以尝试石蜡样本的单细胞实验。但是对于现在的实验方式，基本很难达到比较好的结果。
Q12
冻存液-80保存的单细胞悬液比如
PBMC，复苏之后的活力是否足够用于
scRNA-seq 或 snRNA-seq？
根据实际复苏的细胞活力去看。细胞悬液一定要用冻存液，用降温盒梯度降温的方式保存，而不是说直接把它放到液氮冻存，这两种保存方式对于细胞活力差异是比较大的。所以说根据细胞复苏的情况去看。
欢迎大家继续关注【唤醒沉睡样本库】系列讲座第四期:从常规样本到特殊、复杂样本，论质控的重要性