Neuron︱尼古丁促进焦虑情绪的新发现——抑制腹侧被盖区-杏仁核多巴胺通路的重要作用
撰文︱郑媛嘉
责编︱王思珍
成瘾（addiction）行为主要起因于中皮层的多巴胺（dopamine，DA）系统，可以在成功行为（successful behavious）塑造过程中加工奖惩刺激【1】。目前通过光遗传操作技术已发现了DA细胞的激活可以驱动成瘾行为，并建立了与药物适应性行为（drug-adaptive behaviour）之间的因果关系【2】。但这种观点没有考虑到中脑DA神经元的异质性以及腹侧被盖区（ventral tegmental area, VTA）DA神经元可以平行传递不同信息的可能性。有研究表明，VTA中DA神经元的分子特征不同，对外界刺激的反应也不同【3-4】。DA神经元的信号传递不仅与奖励有关，也与厌恶刺激有关【5-6】。
尼古丁（nicotine）是烟草中的主要成瘾性成分，其通过直接激活烟碱乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptor，AChR）发挥强化学习的作用，nAChR属于五聚配体门基离子通道家族【7】，主要表达于中脑DA和GABA神经元。由于DA神经元传递的双重作用性，因此高剂量的尼古丁也会产生“负面”影响【8-9】。然而，DA神经元如何在应答相同刺激的同时驱动相反的结果，尼古丁的多重效应又如何映射到DA细胞的多样性，仍不清楚。这其中，不同的神经元亚群通过对尼古丁的特定反应，从而可能影响特定的行为，因此，nAChR或其他特征是否可以鉴别这些细胞亚群？
2021年8月份，来自居里夫妇母校巴黎物理化工学院以及法国索邦大学的Fabio Marti和Philippe Faure在Neuron上发表了题为Nicotine inhibits the VTA-to-amygdala dopamine pathway to promote anxiety的文章，证明了尼古丁激活投射伏隔核（Nucleus-accumbens，NAc）的DA神经元，同时也抑制投射杏仁核的神经元。并且利用光遗传对这两种途径进行双向操纵，揭示了它们相反的反应驱动尼古丁产生奖励和焦虑的不同效应。
30mg/kg剂量的尼古丁在静脉注射给药的情况下有加强作用【10】。作者用单细胞电生理记录观察了VTA-DA神经元在急性注射尼古丁后的反应（图1 A）。生理盐水注射的神经元（233个）放电频率变化呈单峰分布，而尼古丁注射的神经元（245个）放电频率变化呈双峰分布（图1 B），其中部分被激活(155个），部分则被抑制（88个），但无论激活或者抑制，其产生的放电幅度均比盐水诱发的反应幅度高，且反应幅度呈剂量依赖性（图1 C-E）。将这两类细胞的解剖位置标记出来后发现，VTA中，受抑制的神经元比激活的神经元更偏于内侧（图1 G）。以上这些结果表明，尼古丁可诱发VTA中DA神经元形成两类神经元群体。
图1 A-G 尼古丁急性注射在VTA DA能神经元中不同的神经元群中引起相反的反应
（图片引自：Claire Nguyen et al., Neuron. 2021;109: 2604-2615）
VTA中的DA神经元可沿中外侧轴投射到不同的区域【11-12】。因此，作者接着通过检测尼古丁诱发的DA神经元的投射位点来研究上述两个神经元亚群是否属于解剖学上不同的多巴胺回路。针对NAc，同时在三个亚核：侧壳（NAcLSh）、内侧壳（NAcMSh）和核芯（core）注射逆行示踪剂：绿色RetroBeads（RB）。2周后检测VTA - DA神经元的自发和尼古丁诱发的活性，并对DA能神经元和激活的神经元进行酪氨酸羟化酶（TH）和神经生物素（NB）标记（图2 A）。结果发现，在投射NAc的DA神经元中，93%（28/30）的神经元被尼古丁激活，而只有7%（2/30）的神经元被抑制。而剩余没有投射到Nac的神经元中79%（15/19）被尼古丁抑制，21%（4/19）被激活（图2 B, C）。表明大多数投射到NAc的DA神经元都是被尼古丁激活的。
用相似的方法，将RB注射到杏仁核（amygdala nuclei，Amg）以靶向亚区基底外侧杏仁核（basolateral amygdala，BLA）和中央杏仁核（central amygdala，CeA），所有记录的神经元再次标记TH和NB（图2 D）。发现，在投射到Amg（BLA和CeA）的DA神经元中，有86%（19/22）被尼古丁抑制，而只有14%（3/22）被激活。相反，DA神经元没有向杏仁核的神经元中有77%（23/30）被尼古丁激活而23%（7/30）被抑制（图2 E, F）。表明大部分被尼古丁抑制的DA神经元投射到Amg。
（图片引自：Claire Nguyen et al., Neuron. 2021;109: 2604-2615）
分析以上尼古丁诱发的NAc投射和BLA投射的神经元的放电频率变化发现，这两种分布具有相反的模式（图2 G）。为了探究这些相反的变化是如何转化为对NAc和BLA不同的DA投射，作者利用光纤和DA传感器（GRABDA2m），实时记录自由活动下小鼠注射尼古丁后在NAcLSh和BLA中DA释放情况。结果显示，尼古丁注射引起NAcLSh中DA的释放增加，而在BLA中DA的释放减少（图2 H-I）。这些结果证实了尼古丁可驱动VTA投射到不同区域（NAc和Amg）的DA通路以产生不同的效应（激活或抑制）。
（图片引自：Claire Nguyen et al., Neuron. 2021;109: 2604-2615）
尼古丁激活VTA区DA神经元可以发挥有益的效应【13-15】，但也会导致负面的影响，比如焦虑或压力诱发的抑郁状态【16-17】，但其潜在神经回路目前并不清楚。因此，作者接下来探讨了上述两个DA不同回路是否与急性尼古丁注射后产生的不同行为有关。结果表明，在腹腔或脑立体定位VTA脑区注射尼古丁后，小鼠在高架O迷宫开臂中的探索实践随着时间而减少（图3 A-B）。
（图片引自：Claire Nguyen et al., Neuron. 2021;109: 2604-2615）
由于尼古丁诱发反应主要是由存在于DA和VTA 区GABA神经元体上的nAChRβ2亚基介导的【15】。在此，作者利用nAChR β2敲除（β2-/-）鼠观察到神经元对尼古丁的反应消失（图3 C左），而利用慢病毒在VTA脑区重新表达nAChR β2（β2-/- Vec）可重塑对尼古丁诱发的神经元反应，使尼古丁诱导的DA神经元放电的增加或减少再次出现（图3 C右）。而在行为学方面，β2 -/-鼠对尼古丁注射并不敏感，没有表现出前述的焦虑样行为，但VTA区再表达nAChRβ2后，焦虑样行为会重新被尼古丁诱发（图3 D）。这些结果表明，急性尼古丁注射的焦虑效应需要通过VTA中的nAChRβ2信号转导，但不能得出是否需要激活和（或）抑制特定的VTA DA神经元群的结论。
图3 C, D nAChR β2敲除（β2 -/-）鼠神经元及行为对尼古丁的反应
（图片引自：Claire Nguyen et al., Neuron. 2021;109: 2604-2615）
由于尼古丁诱导的DA神经元的激活和抑制是相伴而生的，也因为VTA区DA和GABA神经元对尼古丁的反应也是同时的（因为这些神经元都表达nAChR）【15】，因此作者采用光遗传技术，分别操纵两个DA神经元群体。首先将表达CatCh、Jaws或没有视蛋白的YFP植入DAT-Cre小鼠（特异性标记DA能神经元）的BLA或NacLSh并埋置光纤，以观察光刺激操纵对该区域DA神经元终端的影响。作者发现，在BLA中表达jaw的小鼠中，光抑制DA能神经元的终端（即VTA中投射到BLA的DA神经元被抑制）减少了鼠在开双臂的探索时间（图4 A）；在BLA表达catch的小鼠中，光激活DA神经元投射终端则增加了鼠在开双臂的时间（图4 B）。
图4 A, B 利用光遗传技术分别操纵两个DA能神经元群体对行为的影响
（图片引自：Claire Nguyen et al., Neuron. 2021;109: 2604-2615）
由此作者思考，如果激活VTA投射到BLA的DA神经元，是否可以拮抗尼古丁引起的焦虑效应。因此，接下来，作者只在DAT-Cre小鼠的VTA表达CatCh或YFP，小鼠在高架O迷宫测试前1分钟进行尼古丁腹腔注射，并在整个时长9分钟的试验中，BLA始终接受的光刺激。结果发现，激活BLA的DA神经元投射，可消除尼古丁注射的焦虑效应，但在实验的最后3分钟，小鼠在开双臂上所花的时间百分比并没有减少，而且显著高对照组（图4 C）。同时，利用实时位置偏好（RTPP）实验探讨了在动机效价上操纵BLA投射的VTA DA神经元终端的行为结果，观察到光抑制DA神经元终端导致了动物的明显回避（图4 D）。由此表明，对投射BLA的VTA 区DA神经元的抑制在尼古丁产生焦虑效应中起着关键作用。
图4 C, D 投射BLA的DA神经元的抑制会驱动类似焦虑的行为，但不会产生位置偏好
（图片引自：Claire Nguyen et al., Neuron. 2021;109: 2604-2615）
NAc中的DA被认为参与了焦虑类行为的调节【18-19】。因此作者接下来检测了投射到NAc神经元是否也参与了急性尼古丁给药的焦虑效应。用上述相似的光遗传操纵方式对NAc脑区的DA神经元进行实验发现，光诱发激活（表达catch的小鼠；图5 A）或抑制（表达jaw的小鼠；图5 B）在NAcLSh中DA神经元末端对小鼠在开臂的时间没有影响。并且抑制NAc的DA神经元投射，并不能阻止尼古丁产生的焦虑效应（图5 C）。相反，在NAc中DA神经元终端的激活在RTPP测试中诱导了显著的位置偏好（图5 D）。这些结果表明，VTA区DA神经元的NAc投射并不参与尼古丁诱导的焦虑样行为。
图5 投射NAc lsh的VTA DA神经元的激活驱动实时的位置偏好行为，但对类似焦虑的行为没有影响
（图片引自：Claire Nguyen et al., Neuron. 2021;109: 2604-2615）
图6 尼古丁激活NAc DA神经元投射，同时抑制杏仁核DA神经元投射。
（图片引自：Claire Nguyen et al., Neuron. 2021;109: 2604-2615）
本文强调了DA系统在积极和消极动机过程中的复杂作用，并对尼古丁剂量对VTA的影响提出了多方面的可能。同样剂量的尼古丁可以同时通过激活VTA到NAc区DA通路产生奖励效应，并通过抑制VTA到杏仁核DA通路产生“消极”情绪状态。由此，我们也应该思考两个相反信息的回路的同时产生与尼古丁产生的强化效应有什么联系？两种不同回路之间的不平衡是否会导致成瘾，这个问题的深入研究可能有利于戒烟的策略制定或对成瘾机制的理解。
原文链接：https:// doi .org/10.1016/j.neuron.2021.06.013.
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参考文献（上下滑动查看）
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制版︱王思珍
本文完