【期刊】利用内源CRISPR-Cas系统开展乳酸菌基因编辑的研究进展
以下文章来源于生物工程学报 ，作者朱青等
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■ 导读
在CRISPR-Cas基因编辑系统中，得到广泛应用的Cas9蛋白是来源于酿脓链球菌的SpyCas9，但该蛋白在乳酸菌中的应用效率不高。乳酸菌基因组中也有丰富的CRISPR-Cas资源，例如约40%已经测序的乳杆菌中有完整的CRISPR-Cas系统。如能将乳酸菌内源的CRISPR-Cas系统开发成基因编辑工具，对提高乳酸菌的基因操作效率具有很大的意义。
目前嗜热链球菌、清酒乳杆菌、加氏乳杆菌、双歧杆菌、卷曲乳杆菌、乳酸片球菌等乳酸菌中CRISPR-Cas系统已经得到表征，朱青等对这些CRISPR-Cas系统的特征进行了总结，介绍了如何对菌种基因组上的CRISPR系统进行表征、如何解析Cas蛋白识别的原型间隔区相邻基序 (protospacer-adjacent motif, PAM)、如何利用这些信息针对靶标基因构建打靶质粒的详细步骤，对乳酸菌基因工程很有帮助。筛选更多特异性的PAM，对提高乳酸菌的自我靶向基因编辑技术的应用效率十分关键。
标题
利用内源CRISPR-Cas系统开展乳酸菌基因编辑的研究进展
作者
朱青，徐琛，张书文，谢宁，逄晓阳，吕加平
引用
朱青, 徐琛, 张书文, 等. 利用内源CRISPR-Cas系统开展乳酸菌基因编辑的研究进展. 生物工程学报, 2022, 38(7): 2447-2458.
摘要：CRISPR-Cas9技术是一种高效、精准的基因编辑工具，该技术的建立推动基因组编辑进入快速发展阶段。目前应用最广泛的Cas9蛋白是来源于酿脓链球菌 (Streptococcus pyogenes) 的SpyCas9，该蛋白作为“基因剪刀”在哺乳动物、植物等真核生物中应用较为广泛且成熟，但是该蛋白在一些乳酸菌中的应用仍然受到多种因素的限制。乳酸菌基因组上已发现多种类型的CRISPR系统，也蕴含着多种未表征的Cas蛋白，利用乳酸菌内源CRISPR-Cas系统，结合外源导入的向导RNA和同源修复模板，也可实现对乳酸菌基因组的编辑。这种基于内源CRISPR-Cas系统实现基因编辑的方式，具有打靶载体相对较小易转化、无外源Cas9蛋白对宿主细胞产生毒性等优势，相比于CRISPR-SpyCas9更适合于乳酸菌基因组进行编辑，可能是一些乳酸菌未来开展基因组编辑的主要手段，本文重点对此部分内容进行了综述。
乳酸菌 (lactic acid bacteria, LAB) 是一种世界公认安全的食品级微生物，目前被广泛应用于食品发酵领域。近年研究证实，乳酸菌作为益生菌在促进宿主健康方面发挥着重要作用，其代谢过程产生的有机酸和分泌在胞外的抗菌肽，可抑制病原微生物的生长繁殖、改善宿主肠道微生物菌群的结构等[1-2]。尽管越来越多的研究和临床实践证明，乳酸菌及其菌剂具有良好促进健康的作用，在医药和健康领域具有广泛的应用前景[3]，但是乳酸菌的研究和开发仍然面临两个难题，一是乳酸菌菌株种类繁多，常规的乳酸菌筛选是一项耗时耗力的工作；二是随着越来越多乳酸菌基因组被测序，大量未知基因需要进行功能解析，但是传统的乳酸菌基因操作手段过程繁琐、效率低下，亟待开发快速高效的遗传操作工具。
传统的乳酸菌基因操作手段多是基于基因同源重组原理开发的，比如基于染色体和质粒的同源重组方法 (利用乳酸菌内源的同源重组系统)[4]、Red/RecET介导的双链DNA重组 (利用外源噬菌体辅助重组系统)[5]、单链DNA重组[6]等。近年来，以酿脓链球菌SpyCas9为核心的CRISPR-Cas9技术及其衍生技术已经发展成为基因组精准编辑工具，这种方法利用Cas9的两个核酸酶结构域，对特定核酸位点进行切割，使宿主基因组发生双链断裂 (double strand break, DSB)，然后通过对断裂位点进行修复来引入基因突变[7]。乳酸菌和大多数原核生物一样，菌体内通常缺乏非同源末端连接 (non-homologous end joining, NHEJ) 修复机制，需导入同源修复模板或借助外源修复途径修复DSB[8]，这通常导致构建的打靶质粒较大，而对于具有较厚细胞壁的乳酸菌来说，增加了打靶质粒导入宿主细胞的电转难度，这也是CRISPR-Cas9技术在乳酸菌应用时受到的挑战。
最初的CRISPR-Cas系统是在细菌基因组上发现的，它是细菌用来抵抗噬菌体和外源核酸侵染的获得性免疫系统[9]。乳酸菌基因组上同样含有丰富的CRISPR-Cas资源，Crawley等的研究表明，1262个乳杆菌基因组中，59.7%的乳杆菌基因组中可以检测到CRISPR阵列，约40%乳杆菌有完整的CRISPR-Cas系统，对这些有完整CRISPR-Cas系统的乳杆菌进一步分析，结果显示Ⅱ型系统丰度最高，Ⅰ型次之，Ⅲ型系统丰度最低，大部分乳杆菌基因组上仅含有一种系统[10]。笔者团队对副干酪乳杆菌 (Lactobacillus paracasei) 的研究表明，NCBI数据库中已经过全基因组测序的58株副干酪乳杆菌中，CRISPR系统的发生率为43%，其中20株含有Ⅱ-A型系统，5株含有Ⅰ-E型系统，2株同时含有这两种系统。对Ⅱ-A型系统进行了全面的解析和表征，该亚型系统重复序列的长度为36个核苷酸，重复序列保守可以形成稳定的二级结构，不同菌株间隔子数量为11–25个不等，碱基排列顺序非常多样[11]；tracrRNA均存在于cas9和cas1基因中间，转录方向与cas基因相反；通过对所有间隔子序列和原型间隔子序列进行同源性分析，初步预测副干酪乳杆菌的Cas9蛋白 (Lactobacillus paracasei Cas9, lpCas9) 所识别的原型间隔区相邻基序 (protospacer-adjacent motif, PAM)，通过流式细胞术实验和质粒干扰实验进一步解析了lpCas9识别的有效PAM[12]。本团队已利用此系统将一株副干酪乳杆菌基因组上的terminase基因 (与溶源噬菌体包装过程相关的关键蛋白) 成功敲除，获得一株原噬菌体删除菌株，解决因噬菌体进入裂解途径导致发酵失败的问题。目前外源CRISPR-Cas系统在真核生物中应用广泛，但应用于乳酸菌仍然受到一些限制。充分利用乳酸菌基因组上已有的CRISPR-Cas组件，构建的打靶质粒只需要包含相应的crRNA和待编辑位点两侧翼的修复模板DNA，理论上即可成功实现基因编辑。这种策略的优势是：构建的打靶载体无Cas核酸酶基因，可极大缩减载体大小，更易转化进乳酸菌，另外也可以解决异源的SpyCas9蛋白对部分乳酸菌的细胞毒性问题。本文重点对利用乳酸菌自身CRISPR-Cas组件开展基因编辑的研究进展进行总结。
1 乳酸菌CRISPR-Cas系统
1.1 CRISPR系统
CRISPR-Cas系统是一种广泛分布于细菌和古菌基因组上，用来抵御质粒、噬菌体DNA等外源遗传物质入侵的获得性免疫系统。此系统主要由CRISPR阵列和Cas蛋白家族组成，这两部分在不同的微生物之间存在高度多样性。CRISPR阵列由一系列高度保守的短回文重复序列 (direct repeat, DR) 和长度相似但高度分化的间隔序列 (spacer) 相间排列而成[13-14]。CRISPR阵列侧翼常伴随一系列结构功能保守的基因簇，被称为Cas基因簇。不同类型的CRISPR系统含有的Cas数目和种类各不相同，它们在参与不同免疫阶段表现出多种类型的酶活性，例如核酸酶活性、解旋酶活性和聚合酶活性等。根据干扰阶段发挥作用的Cas蛋白的不同将CRISPR-Cas系统分为两大类 (Class1和Class2)[15]、6种类型 (Type Ⅰ到Ⅵ)，Class1系统通过多种Cas蛋白复合物参与降解外源遗传物质，包括Type Ⅰ型、Type Ⅲ型、Type Ⅳ型；Class2系统通过使用单个大Cas蛋白执行相同的功能，包括Type Ⅱ型、Type Ⅴ型、Type Ⅵ型[16-17]。目前利用内源CRISPR-Cas系统成功实现基因编辑的乳酸菌多数含有Ⅰ-E型系统CRISPR-Cas系统或Ⅱ-A型CRISPR-Cas系统，这两类系统主要区别为系统在表达和干扰阶段发挥作用的Cas蛋白种类不同。其中Ⅰ-E型系统带有的Cas蛋白基因簇为cas3-cse1-cse2-cas7-cas5-cas6-cas1-cas2[18]，Cas1和Cas2蛋白在适应阶段共同发挥作用[19]，Cas6蛋白负责将pre-crRNA加工成熟，成熟的crRNA招募多个Cas7亚基、Cas5蛋白、Cse2蛋白、Cse1蛋白组装形成级联复合物 (cascade)；Cas3蛋白则负责外源DNA的切割与降解，即在干扰阶段crRNA-cascade二元复合物与序列相同的外源DNA配对时会招募Cas3蛋白，形成的Cas3-cascade复合物降解非靶标的单链DNA[20]；而Ⅱ-A型CRISPR-Cas系统含有的基因簇为cas9-tracRNA-cas1-cas2-csn2[21]，pre-crRNA的成熟和外源遗传物质的降解都由Cas9蛋白完成，干扰阶段tracRNA与crRNA的重复序列局部配对并招募Cas9蛋白形成三元复合物结构，当此复合物与外源DNA配对时，Cas9蛋白的两个结构域分别降解外源DNA的两条链[22]。
CRISPR-Cas系统介导的免疫包括适应、表达、干扰3个阶段[14]。适应阶段：即新间隔子的获取过程，当外源遗传物质入侵宿主时，在相关Cas蛋白的辅助下将其捕获形成特定长度的片段并整合到最靠近前导序列的位置，形成新间隔子[23]；表达阶段：在前导序列的驱动下，CRISPR阵列转录形成前体pre-crRNA，在单一Cas蛋白或Cas蛋白复合体作用下，pre-crRNA被切割加工成成熟的crRNA[24]；干扰阶段：破坏外源遗传物质的过程，当外源遗传物质再次入侵宿主细胞时，成熟的crRNA与Cas蛋白形成核糖蛋白复合物识别相同序列的外源遗传物质并将其降解，该复合物可识别入侵核酸PAM的方式区分“自身”和“非自身”逃避自我攻击[25]。
1.2 微生物利用内源CRISPR-Cas系统产生自我靶向现象
如果宿主在适应阶段错误获取了针对宿主DNA的免疫记忆，即把宿主基因组片段当作原始间隔序列整合进CRISPR系统的间隔序列区形成新的Spacer序列，宿主的CRISPR系统会把自身基因组的片段错误识别为外源核酸，从而发挥切割核酸功能导致宿主染色体裂解，存在自身免疫的风险[26]，这种现象在乳酸菌宿主中是普遍存在的[27]。
这种自然发生的微生物利用内源CRISPR-Cas系统自我切割现象主要由两种原因导致，即质粒的水平转移和溶源噬菌体进入裂解循环时对宿主基因组的错误包装[28-29]。尽管自我靶向现象普遍发生，且发生自我靶向的宿主基因组被降解，受到强烈的负选择，但是宿主可以通过发生突变或编码抗CRISPR蛋白逃避CRISPR-Cas系统对自身的攻击[30-31]。乳酸菌基因组上也存在这种靶向自身基因组的间隔子，例如嗜热乳杆菌、嗜酸乳杆菌均报道过自我靶向和靶向逃逸事件[26]。这类在乳酸菌菌体细胞内发生的自然事件给予了研究者利用该内源系统实现菌体基因组的精准编辑一个重要启示。
1.3 利用内源CRISPR-Cas系统进行基因编辑
Ⅱ型CRISPR-Cas系统结构简单紧凑、遗传背景被研究得较为透彻，已经开发出了成熟的基因编辑工具并在多种生物中成功应用，例如酵母[32]、小鼠[33]、斑马鱼[34]、植物[35]和人类细胞[36]等。然而CRISPR-Cas9/Cpf1技术在乳酸菌中的应用受到了一定的限制，主要原因是：(1) 构建一个异源表达载体需要表达一个较大的Cas9蛋白基因 (约4.2 kb)、0.4 kb的sgRNA以及约2 kb的同源重组模板DNA，大尺寸的编辑载体不仅难以在微生物中稳定存在，且对涉及多个sgRNA和编辑模板的多基因编辑也有很大限制；(2) 分子遗传工具的限制，乳酸菌是一类细胞壁较厚的革兰氏阳性菌，较大的编辑质粒通常导致较低的转化效率，影响了CRISPR-Cas9技术在乳酸菌中的应用；(3) 目前应用较广泛的SpyCas9蛋白对部分乳酸菌宿主有细胞毒性。乳酸菌基因组上含有丰富的CRISPR-Cas资源，在乳酸菌菌体开展基因编辑，充分利用乳酸菌基因组上的内源CRISPR-Cas组件，可以克服现有编辑系统在乳酸菌上的限制，提高编辑效率。
利用内源CRISPR-Cas系统建立基因编辑工具，首要需要解决的问题是解析该物种CRISPR系统效应蛋白所识别的PAM，只有明确该Cas蛋白识别的PAM，才能够有效激活该蛋白的“基因剪刀”功能。目前已经有多种细菌利用内源性CRISPR-Cas系统实现基因编辑的实例：如利用酪丁酸梭菌 (Clostridium tyrobutyricum) 基因组上的Ⅰ-B型系统实现了多重基因编辑，提高菌株的丁醇生产水平[37]；利用铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) 基因组上的Ⅰ-F型系统删除耐药性相关基因，从临床分离物中分离耐药病原体[38]。这些利用细菌内源CRISPR系统成功开展基因组编辑的研究为在乳酸菌上应用提供了宝贵的经验。
2 乳酸菌利用内源CRISPR-Cas系统基因编辑研究进展
虽然乳酸菌基因组上含有丰富的CRISPR-Cas系统资源，但是CRISPR-Cas含量和类型因乳酸菌菌株水平而异，鲜少有乳酸菌的内源性系统被表征或被开发成新的基因编辑工具。目前为止，已经被表征的乳酸菌种类有嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)[39]、清酒乳杆菌 (Lactobacillus sakei)[40]、加氏乳杆菌 (Lactobacillus gasseri)[41]、双歧杆菌 (Bifidobacterium)[42]、卷曲乳杆菌 (Lactobacillus crispatus)[43]、乳酸片球菌 (Pediococcus acidilactici)[44]等 (表1)。
利用乳酸菌基因组上的内源CRISPR-Cas系统实现基因编辑，首先要表征菌种基因组上的CRISPR系统，并解析Cas蛋白识别的PAM，即可利用这些信息针对靶标基因构建打靶质粒[52]，主要包括以下步骤 (图1)。
(1) CRISPR-Cas系统类型的鉴定：在GenBank上获取某一菌种的所有基因组数据，利用CRISPRCasFinder和CRISPRdb鉴定这些菌体基因组包含的CRISPR系统类型 (cas基因)、间隔子序列和重复序列。
(2) 重复序列二级结构的预测：利用RNA Fold Web Sever软件对重复序列进行二级结构的预测，包括重复序列的碱基配对及茎环结构等。
(3) 间隔序列来源分析：间隔子对应的原间隔序列一般来源于噬菌体、质粒等，使用CRISPR Target (http://crispr.otago.ac.nz/CRISPRTarget/ crispr_analysis.html) 针对数据库中所有已经公开的质粒和噬菌体基因组进行搜索比对。
(4) 预测tracrRNA的位置、序列：tracrRNA典型特征是具有一个反向重复序列结构，该序列可以和pre-crRNA中的重复序列部分互补配对形成复合物，同时tracrRNA经常出现在4个位置：cas9上游、cas9和cas1之间、CRISPR阵列的前后，根据上述特征可以比较容易地确定tracrRNA的全长序列。
(5) PAM的预测及筛选：使用WebLogo程序对原间隔序列进行分析，预测可能的PAM。进行细胞实验验证PAM的有效性，即构建含有候选PAM文库的干扰质粒转化宿主细胞，通过宿主细胞的表型来判断宿主细胞内是否发生了预期的基因编辑事件，从而筛选有效的PAM。
(6) 利用质粒干扰实验检测内源CRISPR系统活性：将spacer序列作为靶标序列，构建一系列带有spacer和PAM的抗性质粒，将这些质粒电转进宿主细胞，利用抗性平板筛选，若与阳性对照相比转化效率显著下降，则说明步骤5筛选的PAM是有效的，并且内源系统活性较好，在宿主基因组上的spacer位点处发生了切割，导致宿主死亡。
(7) 体内实验实现基因编辑：即设计打靶质粒验证是否可以在宿主体内发生基因编辑。打靶质粒的构建，模拟CRISPR系统的结构，在骨架质粒上插入mini-CRISPR基因盒和同源修复模板，mini-CRISPR基因盒是leader-repeat-spacer-repeat结构；对于Ⅱ型系统，也可以直接将成熟的crRNA序列和tracrRNA scaffold结构合二为一设计成一个独立的sgRNA序列，如图2所示，图中的BsaⅠ属于Type ⅡS型限制性内切酶，切割位点在识别位点 (5′-GGTCTCN-3′)下游，因此两个BsaⅠ酶切位点间可以随意更换不同的crRNA，将打靶质粒电转进宿主细胞，用红霉素抗性平板筛选阳性克隆并进一步测序验证。
表1 乳酸菌中已经被表征的CRISPR-Cas系统汇总
图1 CRISPR-Cas系统预测和表征工作流程图[52]
2.1 利用卷曲乳杆菌内源Ⅰ-E型系统实现多种类型基因突变
卷曲乳杆菌是一类存在于人类阴道和家禽肠道的重要共生益生菌，对人类和动物健康有重要影响[53-54]，但是由于缺乏有效的分子遗传学工具、细胞壁较厚导致转化效率有限、遗传背景不清晰等原因，对卷曲乳杆菌的生理生化特性研究进展缓慢[55]。Hidalgo-Cantabrana等研究发现，卷曲乳杆菌基因组包含有完整的Ⅰ-E型CRISPR系统，通过分析其间隔子序列与噬菌体、质粒和细菌染色体的同源性，预测该菌Cas蛋白识别的PAM是5′-AA-3′。通过设计一个仅带sgRNA不带修复模板的靶向自身基因组的自我靶向质粒，电转至卷曲乳杆菌中，结果发现细胞自我靶向死亡概率是99%，证实该菌的CRISPR系统比较活跃。随后研究者设计了3种带不同修复模板的打靶质粒分别验证基因编辑系统在基因缺失、基因插入和单碱基替换的编辑效率，结果显示p-gtf基因缺失效率是100%，终止密码子插入效率是36%，单碱基替换效率是19%。利用L. crispatus的内源Ⅰ-E型CRISPR-Cas系统在该菌基因组上成功引入了多个突变，为进一步理解L. crispatus的生理生化特征奠定了基础[43]。
图2 打靶质粒图谱
2.2 利用变形链球菌Ⅱ-A型系统敲除gtfs基因
变形链球菌是引起人类龋齿的主要病原菌[56]，它不仅可以利用口腔内残留的糖类发酵产生大量酸腐蚀牙齿的釉层；还可以合成胞外多糖 (exopolysaccharides, EPS) 为其他细菌的定殖和聚集提供黏附位点，在牙齿上形成生物膜。为了更好地研究这种生物膜的形成和这类产EPS口腔病原体的功能基因组学，研究者开发了各种靶向目标基因的分子生物学工具，如克隆独立无标记诱变系统、反选择诱变系统[57]。虽然这些方法可以产生变形链球菌突变体，但无标记突变需两次转化，效率低，程序繁杂。李雨庆等对变形链球菌UA159的基因组进行分析，确定该菌株含有完整的Ⅱ-A型CRISPR-Cas系统[58]，利用质粒干扰实验证实了变形链球菌Cas9识别的有效PAM是5′-NGG-3′，与应用广泛的SpyCas9识别的PAM一致，最后选取5′-TGG-3′为后续实验所用的PAM[46]。研究团队以gtfs为靶标基因，利用变形链球菌基因组上的Ⅱ-A型CRISPR-Cas系统元件，实现了gtfs基因的缺失。模仿宿主体内天然的Ⅱ-A型CRISPR阵列的排布，设计出一个带有mini-CRISPR阵列的自我靶向质粒表达盒，在gtfs基因3个不同位点设计相应的crRNA，分别将这3个自我靶向质粒和修复模板转化进宿主细胞，结果显示成功编辑的变形链球菌EPS合成量明显减少，生物膜的形成能力显著下降。这项工作为在变形链球菌中实现基因编辑提供了理论依据，为研究变形链球菌EPS合成和生物膜的形成机制奠定了基础[46]。
2.3 利用乳酸片球菌Ⅱ-A型系统实现多种类型基因突变
乳酸片球菌常用于片球菌素的生产和乳酸发酵，但是除了传统的同源重组方法外，该物种目前没有高效的基因组编辑工具。Liu等[44]对最近分离出的乳酸片球菌LA412菌株基因组进行解析，开发了一种基于内源性Ⅱ-A型CRISPR-Cas系统的基因组编辑工具，实现了乳酸片球菌的无标记基因缺失、基因插入和点突变。利用质粒干扰实验证实了当PAM是5′-NGG-3′时，乳酸片球菌的Cas9蛋白有干扰活性。以pyrE基因 (编码核糖基转移酶) 为靶标，设计了4种识别不同PAM的编辑质粒进行电转，全部成功实现基因的缺失，识别PAM为AGG、CGG、GGG、TGG的质粒缺失效率分别为50%、50%、75%和100%；以mpi基因 (编码甘露糖磷酸异构酶) 为靶标，将突变的核苷酸引入编辑质粒的同源臂，在基因组靶位点成功实现了T→C单核苷酸突变，效率为90%；设计编辑质粒，将l-ldh基因 (编码乳酸脱氢酶) 插入在乳酸片球菌的非编码区域 (GE01508和GE01509基因位点之间) 编辑效率接近100%，电穿孔后，几乎所有的菌落都被鉴定为混合基因型。这项工作为后续乳酸片球菌益生特性的改良奠定了重要基础，例如利用乳酸片球菌的内源CRISPR-Cas系统删除有毒基因、加强乳酸生产途径、提高片球菌素分泌量等。
2.4 利用嗜热链球菌Ⅱ-A型系统实现基因组大片段缺失
与上述利用内源CRISPR-Cas系统实现靶标基因编辑的例子不同，研究者在研究嗜热链球菌自我靶向逃逸机制时观察到基因组大片段缺失[45]。嗜热链球菌基因组上存在Ⅱ-A型和Ⅰ-E型CRISPR-Cas系统[59]，为了比较两种系统的自我靶向效率，选择lacZ基因为靶标，依据两类系统的crRNA结构分别设计了两类自我靶向质粒，将这两类自我靶向质粒电转进嗜热链球菌中，与阴性对照相比，电转了自我靶向质粒的细胞转化效率大大降低，但仍有少部分存活，且电转了Ⅰ-E型自我靶向质粒与电转了Ⅱ-A型自我靶向质粒的细菌存活率比例为9︰1[39]。
对存活菌株基因组测序分析显示，所有Ⅰ-E型幸存细胞含有完整的lacZ基因，但将幸存细胞的质粒回收并测序发现，Ⅰ-E 型质粒是有缺陷的，它缺少间隔子和一个重复序列，所以Ⅰ-E型系统自我靶向逃逸的主要机制是间隔子序列的缺失；所有Ⅱ-A型幸存细胞不再含有lacZ基因，在靶标位点缺失了37.4 kb，占基因组总长的2%，进一步分析发现lacZ基因的上下游存在两个独立的galE基因，且这两个基因即为lacZ基因缺失边界，这表明嗜热链球菌通过两个保守的基因间发生同源重组，修复了Ⅱ-A型系统靶向基因组造成的损伤，这种大片段基因缺失在野生型菌群里以较低的频率发生，基于CRISPR-Cas系统的自我靶向可以筛查出这种罕见的基因组重塑事件。
3 总结与展望
尽管基于SpyCas9蛋白为核心的Ⅱ型CRISPR-Cas基因编辑系统是目前机制研究最清晰、应用最广泛的基因组编辑系统，但是仍然无法满足种类繁多的乳酸菌多种应用场景的需求。相比较于不断优化CRISPR-Cas9技术，充分利用乳酸菌自身基因组的CRISPR相关组件，构建内源性CRISPR-Cas系统对乳酸菌进行自我靶向基因编辑，可以克服目前CRISPR-Cas9技术在乳酸菌应用上的缺陷和不足，未来可能更有潜力。利用内源CRISRP/Cas基因编辑工具箱对乳酸菌进行基因修饰，以改善益生菌性状、增强其发酵性能、定殖宿主肠道将具有广泛的应用前景。例如利用内源CRISPR系统，结合sgRNA和带有突变位点的模板，将单核苷酸突变引入嗜热链球菌的epsC基因上，可以增加EPS的合成、改善酸奶的流变特性、增强其感官特性；利用已经表征的双歧杆菌CRISPR-Cas系统，将外源β-半乳糖苷酶插在双歧杆菌基因组上，可以提高双歧杆菌代谢寡糖的能力，从而增强该菌株在肠道的定殖能力。但是这种自我靶向基因编辑技术仍然面临一些问题需要解决：(1) 特异性PAM的确定。同一物种存在多种类型的CRISPR阵列，甚至同一类型的CRISPR-Cas系统有多种潜在的PAM位点，但是目前生物信息预测PAM的手段有限，预测的PAM可能与Cas蛋白所识别的最优PAM有偏差，导致基因编辑效率不高。现阶段解决这个问题只能依赖于构建数量庞大的PAM库，通过实验来筛选有效的PAM，这大大增加了实验的工作量。(2) 无法生成适合多种微生物的通用工具盒，因为PAM位点具有物种特异性，不同生物识别的PAM位点的长度、简单性、位置都不同，针对不同的研究对象都要重新确定PAM位点。后期还需要对每种类型的CRISPR-Cas系统进行深入研究确定常见的PAM的位点，通过评估高度普遍的PAM或经过验证的同源物种的PAM来确定目的菌株的PAM位点。
当前我国人均GDP超过1万美元，已昂首迈入营养健康时代，人民群众对于营养健康的追求比以往任何时候都迫切。在这个时代，促进人体健康方面具有巨大潜力的乳酸菌遇到飞速发展的基因编辑技术，我们完全可以利用安全的乳酸菌作为底盘细胞按照需要去定向改良乳酸菌菌株的发酵性能、益生性能，甚至我们可以畅想在不远的未来，按照合成生物学的理念去设计、开发和定制新型乳酸菌，达到促进人类健康和治疗疾病的目的，这将对整个社会生产生活方式产生巨大的影响。
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