Vege Res | 使用激光捕获显微切割TMT定量蛋白组学技术分析番茄减数分裂期花粉母细胞高温诱导蛋白组的变化
番茄 (Solanum lycopersicum L.) 花粉发育适宜的温度为21-24℃。当环境温度高于一定的限值时，植物的生长生殖发育会受到不良的影响，诱导高温胁迫 (Heat Stress)。花粉发育期对温度最为敏感， 高温胁迫 会导致花粉败育 和 凋亡。没有完成正常授粉受精番茄果实出现空腔 (无子)，变小，导致果实的品质和产量下降。在我们多年的研究过程中发现， 番茄根砧品种‘Maxifort’（Solanum lycopersicum L. x S. habrochaites)雄花发育表现出极其高的抗热性能。前人有关花粉 抗热的研究主要针对花粉成熟后期花粉囊开裂之后，次期可以收获大量的花粉样品。花粉发育前期，花粉母细胞被包裹在完整的花粉囊内，而完整的花粉囊壁由药室内壁，中层，和绒毡层三层细胞组成。获取均质的花粉母细胞存在很大的技术难度。
本实验使用‘Maxifort’，首先确定了含有减数分裂期花粉母细胞的花苞尺寸，然后用冰冻切片机把花苞横向切出20微米厚的样品切片，最后再用激光捕获显微切割技术（LCM）获取到正在进行减数分裂的花粉母细胞均质样品。针对LCM微量样本，我们开发了用 Barocycler压力循环技术提取蛋白的方法。使用tandem mass tag (TMT) 蛋白定量分析 方法；定量分析出6343个花粉母细胞蛋白，其中254个蛋白在高温胁迫下有显著差异。对差异蛋白的功能分类分析表明：1）高温诱导的96个蛋白主要包括热激蛋白，热应激转录因子，钙网蛋白以及胞吐作用相关的蛋白；受影响的生物功能主要涉及新合成蛋白的折叠和细胞内定向传输，变性蛋白的重新折叠以回复次级结构，和移除细胞内变性聚集及受损的蛋白；2）高温抑制的158个蛋白主要参与泛素介导的蛋白降解途径、抗氧化机制以及碳水化合物和脂质的代谢等生物学过程；3）影响减速分裂过程中染色体分离 和 程序性细胞死亡 的 关键蛋白在高温胁迫下发生了显着变化。这些高温诱导蛋白可直接参与雄性配子体早期发育阶段的耐热机制。综上所述，本研究开发了用LCM收集统一无杂质的花粉母细胞的方法，实现了对微量的LCM样品进行蛋白质组学的定量分析。本实验体系可有效用于从多细胞复杂生物组织样本中 分离单一种类的细胞 进而进行与其功能相关的蛋白质组学研究。
图1 实验过程图解
田纳西州立大学农学院周素平教授为论文的通讯作者，李卉博后论文第一作者，田纳西州立大学秦耀国，吴兴波，Joshua O’Hair，Jesse Potts，美国农业部植物、土壤和营养研究所杨咏，Tara Fish，Therodore Thannhauser也参与了该研究。该研究得到了1890 Institution Teaching, Research and Extension Capacity Building Grants (CBG) Program，Award No. 2018-38821-27737, 2014-02868 （美国农业部国家粮食和农业研究所对1890年学术机构教学科研及推广能力建设基金）和Evans-Allen Research Funds from USDA-NIFA（美国农业部国家粮食和农业研究所Evans-Allen研究基金）的赞助。
作者团队介绍
周素平教授实验室主要研究方向：用分子生物学方法（基因组，转录组，蛋白质组学，以及单细胞组学）研究非生物胁迫（铝，盐，干旱，高温等）对植物（番茄为主要研究模型）基因及蛋白表达差异的影响。并通过CRISPR基因编辑技术验证植物基因功能。
About Vegetable Research
Vegetable Research是一本开放获取的期刊，致力于传播蔬菜作物研究进展。欢迎蔬菜研究所有领域的原始研究论文、方法、资源和综述等投稿，主题范围包括（但不限于）遗传、育种、组学、分子生物学、生物技术、与环境和其他生物系统的相互作用以及采收前/后的生产。期刊主编由美国农业部农业研究署（USDA-ARS）研究员、威斯康星大学翁益群教授与中国农业大学张小兰教授联合担任。
期刊官网：
www.maxapress.com/vegres
投稿网址：
mc03.manuscriptcentral.com/vegres
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