【干货】"细胞毒性，增殖，活力检测实验"攻略大全！！

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¤ 细胞毒性试验

对于抗肿瘤药物的体外抗肿瘤活性评价来说，可以用MTT法或者CCK-8法来考察药物对肿瘤细胞的增殖抑制作用，这种情况下称为细胞增殖抑制实验；

如果是评价一种药物或者一种新型材料的使用安全性，这种情况可以称为细胞毒性实验，方法都是一样的。

1实验原理

CCK8, 全称为Cell Counting Kit-8，在电子载体1-Methoxy PMS存在的情况下能够被细胞内脱氢酶还原成具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）， 黄色甲瓒产物与活细胞数量成正比，即颜色的深浅与细胞的增值成正比。因此可以用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

MTT 比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒 (Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收光值，可间接反映活细胞数量。

2操作步骤

因为无论是MTT法还是cck8法检测时都是采用酶标仪进行检测，检测使用96孔板，因此，如果一开始是检测药物或者液体材料对细胞的毒性或者增殖的影响，那么就直接使用96孔板，如果检测固体材料，可以使用24孔板。

下面以96孔板为例：

1. 细胞接种96孔板（贴壁细胞）

每个孔接种细胞数一般为2*10^4，根据细胞需要生长的时间，细胞数目不多于10*10^4。每个孔100ul，沿着孔的内壁加入，可以使用排枪加入，保证每个孔的细胞数目一样，接种3-5个副孔。

2.细胞培养一段时间，时间不定，待细胞长到70%-80%时可以进入下一步

3.测定药物/液体材料对细胞毒性的浓度大小，加入不同浓度药物与空白组对照，选择不同时间来测定IC50， 24h，48h，72h最为常见。

（注意：计算药物的使用浓度，将药物用10%的培养基进行稀释，药物与培养基总体积为100ul）

4.按24h来做的话，那么当3中的药物，接种了20h的时候加入CCK-8试剂，每个孔加入20ul（加CCK-8时，10ul不好加，此时沿着孔内壁与液平面交界处加入比较容易加入），然后每隔一段时间，15min，30min将其放入酶标仪450nm处测读数，CCK-8最后测读数别超过4h。

如果是MTT的话，在时间达到后，加入5mg/ml MTT 20ul,放入培养箱继续培养4h，这时候细胞就会被终止培养，小心的吸去孔内的培养基，然后加入150ul的DMSO,使得结晶物完全溶解。然后在570nm处检测。

MTT加入前                  MTT加入并培养4h后

结果呈现如图所示

CCK8加入前：                       

CCK8加入后

结果呈现：

3两者区别

加入CCK-8后活细胞生成的具有高度水溶性的黄色甲瓒产物，由于其毒性较小，需要摸索检测时间

而加入MTT后活细胞生成的为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒

CCK-8对细胞毒性较小，这也是与MTT区别较大的地方

4Tips

对于悬浮细胞来说，建议使用cck8法，因为MTT检测的是细胞内的物质，加入MTT4h以后，需要先将MTT吸出，再加DMSO溶解，这一步骤容易造成很大误差，CCK8法可以规避这一风险。

对于固体材料来说，建议使用24孔板进行实验

以下为24孔板方案：

1)  在材料和细胞孵育结束后，加入400μl培养液，100μl MTT溶液，放入培养箱中培养4h；

MTT溶液配制：5mg/ml MTT粉末，例如，50mgMTT粉末，加入10mlPBS溶液；

配好后，摇匀，后过滤，后4℃避光保存。新液体只能保存2周，最好现用现配。

2）4h后，吸走表面溶液，加入500μlDMSO，振荡15min，溶解结晶物；

3）移入96孔板中，每孔100μl，4个孔，放入酶标仪，用570nm进行测试。

¤ 细胞活力测定

细胞活性测定方法有台盼蓝染色法，克隆形成法，MTT法, Calcein-AM/PI双染法等

1Calcein-AM/PI双染

Calcein-AM是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂

PI是一种对死细胞进行荧光标记的染色试剂

由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞

PI染色

Calcein-AM染色

from东仁化学科技(上海)有限公司

Calcein染色、PI染色以及双染

From 百度图片

2克隆形成法

一、细胞克隆形成实验原理

当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测，细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。因此我们可以用这种方法检测细胞的增殖能力差异。

二、实验方法

平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验
(a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞
(b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。

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