每当我们一提到蛋白免疫印迹杂交实验（Western Blot）的时候，相信做科研的小伙伴们都会“虎躯一震”，洪荒之气猛冲天灵盖，满脑子的问号：我是谁？我在哪？为什么酱紫对我？
这个实验室最最基本的技能，我们对她真是又爱又恨却又割舍不下。
好看的条带“千篇一律”，而我的总是“出其不意”，那么，不禁要思考一下，为什么我就做不出一张条带清晰、背景干净、没有杂带的结果呢？别急，今天我们就来分析一下这个“小妖精”磨人的招数，一一将她打破，降服。
WB相信大家并不陌生，其主要是利用聚丙烯酰胺的分子筛效应，根据蛋白质亚基分子量的大小将其分离开，然后进行目的蛋白质的检测。在此我们就最常见的细胞样本的WB展示一下实验流程
了解了WB的基本流程之后，就要开始我们的“WB奇妙之旅”了，本次列车通往WB结果的乐园，中途不许下车哦，你期待吗？😉对于不同样本的制备，我们根据不同种属，不同来源，不同定位来制备所需要的样本，基本有以下几类，以供列位“实验人”参考。在种属方面主要有动物、植物和微生物三大类，而从细胞定位上，使用的裂解液及蛋白提取试剂盒又也是不同的。其实在样本制备的过程中，我们会遇到很多问题，而这些问题又会导致不同的结果产生，因此制备样品时一定要按照相关试剂盒说明书或者实验步骤来进行，才能保证后续顺利进行。1）在电泳的过程中，首先我们要注意的是，在低电流，低电压的条件下跑出来的条带相对比较清晰，蛋白的条带比较凝聚，不容易出现条带弯曲倾斜的情况，缺点就是时间会比较长。2）制胶：根据目的蛋白的分子量大小选择配制合适浓度的分离胶，在配置过程中玻璃板一定要清洗干净，分离胶不要加太满，要使蛋白样本有足够的浓缩时间；胶的凝聚要充分且均匀，不要有气泡。3）转膜：注意海绵垫，滤纸，膜，胶的叠放位置，以确保正确的转印方向；在胶和膜之间确保不要有气泡！不要有气泡！不要有气泡！重要的事情说三遍。4）封闭和抗体孵育：封闭的时候，要有足够的封闭液，封闭时间要足够充分；一般一抗孵育是在4℃静置过夜，若是抗体特异性好，信号强的话可以抗体室温摇床孵育2h左右；二抗一般室温孵育1h即可。洗膜用标准的TBST缓冲液，摇床清洗3次，每次10min，若是判断由于抗体原因导致背景过高，可以把洗涤次数提高到4~6次。5）显影拍照：加过显影剂之后，注意调节曝光时间，拍照模式，根据实际情况进行调整，以达到最佳效果。历尽千辛万苦，熬过万般磨难，终于到了我们实验的最后一步，那就是对结果的分析，我们不仅要学会做出一个满意的条带，还要了解对于条带是怎么分析的。
对于WB的结果来说，最常用的就是Image J软件了，下载链接：https://imagej.nih.gov/ij/download.html，在网站中按照机型下载安装就行。Image J的使用非常简单，在此我来简单介绍一下。 2）单击File Open在文件夹中找到WB图片；3） 把图片转化成灰度图片：Image Type 8-bit；4）消除图片背景的影响：Process Subtract Background，在弹出的对话框中，填上50基本就可以了，并勾上Light background，点击OK。此时图片背景会变白一些。 5）设置定量参数：Analyze Set Measurements。在弹出的对话框中勾选Area、Mean gray value、Min& max gray value、Integrated density。6）设置单位：Analyze Set Scale。在弹出的对话框“Unit of length”后面填上“pixels”，其他的不用改动，然后把WB图片转换成亮带：Edit Invert7）选择菜单栏下的不规则圆形工具，将圆圈手动拉倒第一条带，并尽量将条带都圈起来，单击Ctrl+m，即可弹出你选定区域的灰度统计值。结果中的IntDen即积分灰度值。 8）手动移动不规则圆圈至下一条条带，重复步骤7，直至所有条带都被测量，选结果中的“Edit”的“Select All”，然后复制数据“IntDen”到Excel表即可进行分析。 9）在excel表格中将目的蛋白的灰度值除以内参蛋白的灰度值，进行归一化处理，在Graphpad Prism软件中作柱状图。Western blot 超值福利享不停
活动时间：即日起至2021年1月30日
活动内容：蛋白互作、表达差异、目的蛋白验证，WB检测少不了，2021年文章怎么能缺少几个完美的条带 ~
活动详情：凡即日起在科学指南针平台预约Western blot，满2000即可享受6折优惠（包含提取蛋白和WB检测部分），实在是太可了！ 🤩