生物小白的入门必修课——RNA的制备

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2021年4月12日，第1稿。

一、实验背景知识

    分离和制备纯净、完整的RNA对于分子生物学实验是很重要的，是基因表达分析的基础，也是进一步分子克隆的基础。

    在各类RNA实验中，分离分离获得完整的RNA是成功的关键。而实验失败的主要原因是RNA酶的污染。RNA酶在自然界中的存在十分广泛，且存在少量的RNA酶即可引起样本的严重降解。因此，实验全程应当在无RNA酶的前提下进行。现市售商品化的除RNA酶的试剂很多，已做除酶处理的各类耗材亦十分常见，故本文不再赘述。

    抽提RNA的方法包括异硫氰酸胍法、酚/SDS法等。其中，异硫氰酸胍法（或TRIzol法）是我们比较常用的从组织或培养的细胞中一步法提取RNA的方法。所有分离提取RNA的方法均是在能导致RNA酶变性的化学环境中裂解细胞，然后将RNA从各类生物大分子中分离出来。最终的实验用途，决定了我们方法的选择。

    所需重要试剂介绍：

    TRIzol其含有苯酚（为主要成分）、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放核酸酶。   

    DEPC水是用DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的超纯水（一级水），无色液体。经检测不含杂质RNA、DNA和蛋白质。DEPC水可以用于RNA沉淀的溶解，含有RNA的各种反应体系如反转录、siRNA的退火等，以及其它各种要求无RNase、DNAase和proteinase的反应体系。

二、实验所需试剂耗材

1. 新的口罩，帽子，手套
2. 无RNA酶的枪头
3. 无RNA酶的1.5ml 、200μl离心管
4. PBS或D-Hanks（无菌最佳，干净亦可）
5. Trizol试剂（4℃预冷）
6. 氯仿
7. 异丙醇（4℃预冷）
8. DEPC水（4℃预冷）
9. 75%乙醇（DEPC水配制，4℃预冷）
10. 离心机、恒温金属浴 （4℃预冷）
11. 掌上离心机
12. 废弃枪头盒

三、实验阶段

    1.准备实验台面：

    在小编的多数教程中，都会反复强调台面的干净整洁。我们会推荐提蛋白或提DNA/RNA等的操作都在超净台内进行。若是确实实验条件不满足，我们也应当保证操作台面的尽可能的清洁。

    保持操作台面的整洁也是任何实验操作都需要养成的良好习惯，整洁的操作台面，反映着一个合格的实验员清晰的操作思路。

    当确认按照实验准备阶段的要求准备好实验所需的物品后，就可以从细胞间取出细胞了。

    在RNA提取实验正式开始之前的细胞准备阶段，可以用细胞汇合度约70~80%的细胞直接制样，或消化、计数、离心后制样。推荐一个样本制样所需细胞数量应不小于50万个。

    2.清洗细胞或组织：

    推荐所有操作冰上进行（金属浴上进行），避免RNA降解。

    倒出或吸出单层贴壁细胞培养液，D-Hanks清洗三次，瓶子立起，彻底吸净挂壁液体。

    3.TRIzol处理：

    培养瓶内加入1ml TrizoL。立即轻轻颠倾3-4次（操作同消化细胞），使液体流经底面细胞层，确保裂解液充分均匀分布细胞表面。用枪头吹打液体（操作同消化细胞），使细胞破碎，液体由黏稠至清亮透明。初始为拉丝样黏稠液体，至不粘稠状态。说明书荐，每10cm²表面积培养皿加入 1ml TRIzoL，而经验的，T25培养瓶加入1ml已经足量。

    将液体收集于1.5ml无RNA酶的EP管中，补入200μl氯仿。氯仿液体较重，移液动作应当干脆，避免拖沓，因为移液枪不能很好的留持住氯仿，液体会以较快的速度不断漏出枪尖，致移液不准，甚至腐蚀被溅到的物品等。吸取氯仿时，亦应当避免移液枪柄粘到氯仿，以免腐蚀移液枪。推荐的移液动作为枪尖微向下，移液的位置尽可能靠近加液的位置。

    加入氯仿后，可以观察到样本分层，其中透明的氯仿层密度较大，位于管底部位。

    用手使劲摇离心管30s。手摇力度要大，但又不可使用涡旋器，因为涡旋易使RNA链断裂。摇动后可见样本呈草莓奶昔样混浊。

    样本于4℃金属浴内静置。

   将各样本同时静置10min沉淀，以避免各样本沉淀不均。一般到4-5min时就可看见分层（分两层），若10min后仍未分层，可再使劲摇30s，继续静置5min。

    4.离心，样本分层：

    12000g离心，15min，4℃。离心后可见样本分为三层。透明澄清的上层是含RNA的水层，中间的白色膜状物及粉红色的下层是含DNA和蛋白质的有机层。

    小心地将透明、澄清的上层水相转移至新的离心管备用。大约转移400~500μl，如果没有十足的把握，请少转移一些液体，同时强调，注意避开管壁白色沉淀。因为经验上，最终提取的RNA量是足量的。过度移液导致的误吸中间层或下层液体的低级错误将难以挽回。

    5.转移水相液体，补入异丙醇析出RNA沉淀：

    向水相中加入与上一步转移的上清等体积的已经预冷的异丙醇（如上一步转移了500μl的液体，则补入500μl的异丙醇）。加入异丙醇后即可看见分层，其中上层可见飘着的絮状白色沉淀。此时，心中应当长舒一口气，嗯，看见RNA了。

    将样品管上下颠倒混匀，勿剧烈。混匀后液体呈透明、清亮液体。

    6.离心，收集RNA沉淀：

    再次静置10min，期间离心机预冷。

    静置结束后，离心（12000g，4 ℃，10min）。此处有一个小技巧，或者叫做好习惯，即离心时，离心管保持一个方向，因为离心后的沉淀可能很小，对于初学者而言往往难以观察。保持离心管的同向，可以让我们预判沉淀出现的位置。

    离心完成后可见，试管底部为RNA沉淀，白色或乳白色沉淀物（部分人称之为耵聍状沉淀）。

    7.乙醇清洗RNA沉淀，离心收集沉淀：

    小心抽弃上清，补入1ml的75%的乙醇（DEPC水配制）。上下颠倒使沉淀破碎，静置5~10min。静置期间，离心机预冷，7500g，4℃。此处也有个小技巧，即使用蓝枪头套白抢头，抽弃上清。我们推荐尽量一次性干脆利落的将上清遗弃，避免反复移液带来意外，故推荐使用蓝枪头。而蓝枪头的枪尖过于粗大，可能直接吸走沉淀，故套上白枪头，增加操作的精密性。

    再次离心（7500g，4℃，5min）。小心抽弃上清（操作同上一步），强调此处尽量抽吸干净，否则样品难以干燥。湿润的RNA沉淀呈现半透明白色，依稀可见。

    8.风干RNA沉淀：

    常温干燥或超净台内低速通风干燥（推荐使用超净台干燥）5min。干燥后的RNA沉淀透明，几乎不可见。

    9.溶解RNA样本：

    沉淀中加入30~50μl DEPC水重悬RNA沉淀，手指弹匀（避免使用移液枪吹打，可导致RNA链断裂）。掌上离心机稍离心，将样品集中于离心管底。

    10.检测RNA样本浓度：

    使用超微量分光光度仪，检测样品RNA浓度。仪器使用方法不做赘述，但强调一点，无论是何种型号的超微量分光光度计，均为精密仪器，操作臂务必轻拿轻放，操作时手上有个支点，用以抵抗关闭操作臂时瞬间的磁力吸引。

    纯净的DNA和RNA在A260和A280都有吸收值，但以260最高。核酸提取过程中最主要的污染物蛋白质在A280处有强烈的吸收值，所以计算这两个吸收峰的比值就可以确定核酸的纯度。DNA的这个值一般是1.8～2.0，而RNA则是2.0。另外，如果要求高的话，我们还会要求测量A230的值，正常情况下，核酸的A260/A230和A260/A280是一致的，如果这个值上升则样品可能会含有多糖类的污染。

    11.RNA样本的处理：

    我们不推荐对RNA样本进行保存，条件允许的话，应当立刻反转录为cDNA，并尽快完成后续qPCR或其他实验。

    关于RNA和cDNA样本的短期保存，应当置于4℃或是-20℃，现仍有争议。所以，尽快完成实验，以不变应万变，才是王道。

四、后续实验

    进一步的反转录与实时荧光定量实验，且听下回分解。

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