生物小白的入门必修课——细胞计数

上回书说到，细胞培养其实很简单。那么接下来，我们进行细胞计数的学习。

一、实验背景知识

我们的日常实验中，有大量需要计算细胞密度，从而进一步计算接种浓度或数量的情况。如下图所示，为一块血球计数板 (Hemocytometer)，即我们常用的经典的细胞计数工具。

在血球计数板上，刻有一些符号和数字，XB-K-25为计数板的型号和规格，表示此计数板分25个中格（即汤麦式）。计数区边长为1mm，则计数区的面积为1mm，每个小方格的面积为1/400mm²。

二、计数步骤

1.准备细胞计数板：

在准备计数的细胞悬液之前，我们需要提前擦拭干净计数板。所谓干净的标准，就是在镜下观察计数板，见计数池内没有影响后期观察的纤维或杂点。使用大量75%乙醇喷洒计数板，令流动的乙醇带下计数板上的灰尘及细碎纤维（文明操作，在乙醇流下的地方垫上干净的布，或用废液缸接着，不要流的到处都是）。使用一块干净柔软的布（例如眼镜布）擦拭干净计数板和盖玻片，将盖玻片覆盖在计数板的计数池上方，将计数板转移入超净台。

2.准备细胞悬液，接入细胞计数板：

超净台内消化细胞。取50~100μl的细胞悬液（必要时可提前将细胞悬液稀释10倍或更高倍数），在上下两个计数池的盖玻片的边缘滴上一滴细胞悬液，令其虹吸进入计数池。强调动作稳定，勿推动盖玻片。因为细胞计数并不需要严格无菌操作，因此可使用左手食指稳住枪头，再滴液体。再强调一点，左手食指可以接触枪头，但如前文细胞培养中所述，一定不能接触枪柄部分，以免影响后面细胞培养的无菌操作。

细胞悬液进入计数池后，静置片刻，将计数板稳定地转移至显微镜下进行计数。强调稳定，是为了避免因为晃动导致细胞悬液不均匀，甚至晃出计数室。

关于静置片刻，这句话其实很有深度。有人建议是静置5min，待细胞稳定沉降进入计数池后，再计数。在小编的实际操作中，其实不是很等的住这5min。小编认为，贴壁细胞消化下来，还是要尽快操作，因此选择尽可能稳定地转移计数板，而不再等待。小编的选择不一定对，欢迎交流讨论。

3.显微镜下的细胞计数板：

镜下可见的计数池如下图所示，分为两种。本文以汤麦式为例。

计数板由H形凹槽分为上下两个计数池。将盖玻片覆盖在两个计数池上方，形成深度为0.10mm的计数池。每个计数池又分为9个大格（下图红色边框大方格），每个大格规格为1.00mm×1.00mm。其中，中央大方格又用双线划分为25个中方格（下图绿色边框中方格或图中浅红色区域），每个中方格用单线划分为16个小方格（下图蓝色边框小方格）。

4.计数方法：

（1）推荐计数方法1：

如步骤3所述，推荐计数大方格（红色边框大方格）内的细胞数量，两个计数池一共有8个大方格，计得数量记为N。计数原则：计上不计下，计左不计右。

则细胞悬液密度为：C1=(N/8)×104个/ml

推导：前述可知，每个大方格的容积为0.1mm3，即0.1×10-3cm3，即0.1×10-3ml，即C1=（N/8）/（0.1×10-3ml）=(N/8)×104个/ml

若计数前，细胞悬液稀释倍数为M，则修正的细胞悬液密度为C=(N/8)×M×104个/ml

（2）备选计数方法2：

记中方格（绿色边框中方格）细胞数量，两个计数池共10个中方格，计得数量记为X。

    则细胞悬液密度为：C2=(X/2)×5×104个/ml。

（3）两种方法比较：

方法1计数面积较大，因此计数更为准确，方法2计数面积较小，在细胞数量较多的情况下，计数速度更快。方法的选择嘛，仁者见仁智者见智。

5.清洗细胞计数板：

清洗方法同步骤1，大量酒精喷洒冲洗，注意文明操作。擦干，放回盒内保存。不推荐将计数板泡在酒精中，偶尔出现太久没人使用，酒精晾干了的情况，这时候的计数板是相当难擦干净，前人的眼泪，希望后生引以为鉴。

利益声明：

本教程未涉及任何商业推广，所用试剂、耗材可根据各课题组需求酌情更换。

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