生物小白的入门必修课——（平板）克隆形成实验与姬姆萨染色

一、实验背景知识

一般的，正常细胞的增殖需要细胞与细胞之间的信号传递，而肿瘤细胞具有激活增殖的特性，其可由单个细胞增殖形成大量的子代细胞，最终形成一个细胞克隆。

克隆形成实验作为一项肿瘤学的经典实验，能够直观的反映细胞的群体依赖性和增殖能力。

克隆形成实验可分为平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验两种，本次实验以平板克隆实验为例进行介绍。

二、细胞种植

平板克隆实验通常使用60mm的培养皿进行细胞种植（最终拍照更好看），特殊情况下，亦可选用培养瓶进行实验。例如小编的这次实验，因为需要带着细胞长途跋涉去辐照干预，为避免途中细胞污染，最终选用了细胞培养瓶进行实验。

细胞接种时，要求接种密度足够低，最好时做到镜下观察时每个视野或每2~3个视野存在1个细胞为佳。经验的，60mm培养皿或25T的培养瓶，每皿或每瓶接种500~800个细胞。待细胞贴壁且状态良好（一般从种植到干预，约24h，时间过长，细胞可能就已经开始克隆生长了），就可以干预处理了。

二、日常观察

一般来讲，在细胞种植后的第5天左右，就可以在显微镜下看到克隆形成的趋势了。

待到每个克隆的细胞数量约50个以上，或出现肉眼可见的克隆时，就可以中止培养，进行染色了。

三、姬姆萨染液的配制

首先提供一个官方版本的吉木萨染色的配方，不过本文不采用这种复杂的方法。姬姆萨染色，其实可以很简单。

官方版配方：姬姆萨配液，使用甲醇配成10×，以1g的姬姆色素染料加入66ml甘油，混匀，60度保温溶解两小时，再加入66ml甲醇混匀。

简化版配方：直接使用甲醇，将姬姆色素粉末或结晶紫粉末溶解至终浓度0.1%（m/v），即0.1g染料粉末，溶解至100ml甲醇中。染料粉末是课题组“祖传”的怎么办？不要紧，超过保质期过久的粉末，可能出现溶解不完全的情况，并不要紧，拿滤纸过滤去除杂质沉淀即可。

简化版的配方，仁者见仁，智者见智，慎重采用。小编认为，克隆染色的重点在细胞种植和克隆培养，这两步做好了，克隆不染色也看得见。至于染成什么颜色，并不那么重要。不一定对，朋友们自己判断。欢迎文末留言区发言，diss小编。

四、姬姆萨染色

仍然首先强调台面整洁。

使用干净的PBS或D-Hanks轻柔清洗细胞，洗净培养基。

每皿或每瓶细胞加入2ml甲醇处理15min，固定细胞。此处有几处小知识。前面培养基如果没有清洗干净就直接加入甲醇进行固定的话，甲醇可以导致培养基析出白色絮状杂质，严重影响之后的染色。此处使用甲醇固定，与前面提到的简化版染液配方有关，前后统一为甲醇，我们可以一步法做到固定和染色。

对了，还要强调一点。在细胞固定之前，克隆贴壁不能算是牢固。因此，应当避免加入的液体垂直冲击细胞培养面。前面D-Hanks清洗的时候，也是同理。具体操作如图。

固定完成后，可见克隆发白，清晰可见。

往培养瓶或培养皿中补入染液。约2ml，染液能够覆盖细胞且不会在染色过程中干涸即可。染液如果在染色过程中干涸，局部会留下清洗不去的污渍，导致试验失败。

低速摇床染色2~3h。

染色后，清洗前的效果。

染液回收，下次可重复使用，直至染色效果不佳为止。

培养瓶中或培养皿中补入超纯水，清洗干净。不要疑惑，没错，用超纯水就可以了，就是这么简单粗暴，欢迎文末留言区留下你的diss。当然，自来水不行，因为自来水烘干后会留下大量水垢，严重影响最终观察效果。

最终清洗后的效果。

最终拍摄效果。

    至此，配实验结束。

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