聚焦医学前沿 || 双发射荧光分子探针有多牛？洞悉致病机理，推进精准治疗传染病！

研究背景

由于细菌致病性的演变、外来病原体的出现和抗生素耐药性的传播等原因，细菌感染仍然是全球面临的一项重大挑战。近年来，人们对感染的发病机制、宿主防御机制和抗菌机制进行了广泛的研究，包括动态炎症反应、免疫激活和致死作用。在与传染病有关的各种生物活性因子中，吞噬细胞衍生的自由基广泛参与调节细菌诱导的炎症级联反应和触发内在的杀菌作用，例如活性氧（ROS）和活性氮（RNS）等。然而，传统的终点分析（End-point analysis, EPA），如组织学和生物化学分析，往往不能实时监测自由基状态和感染病理演变之间的复杂相互作用，因此，迫切需要开发简单有效的方法为精确诊断和治疗提供新的视角。

工作介绍

近日，新加坡南洋理工大学邢本刚教授课题组研究团队报道了一种双波长近红外荧光分子探针（HCy5-Cy7），用于监测体外和小鼠体内细菌感染的炎症部位的多种自由基的变化，为了解细菌的致病机理，推进精准治疗传染病提供了新的视角。

1. HCy5-Cy7具有双发射波长，HCy5发射波长在660 nm；Cy7发射波长在800 nm。

2. ROS氧化HCy5，可以开启其在600 nm处的荧光；RNS降解Cy7，使其在800 nm处荧光减弱。

3. 这种独特的多光谱信号变化使HCy5-Cy7能够研究动态氧化/亚硝化应激，从而将其应用于体内外细菌感染的致病和防御过程的监测和研究。 

Scheme 1. 细菌感染的发病机制和宿主防御

及HCy5-Cy7多自由基成像的设计和原理

该工作发表在Angew. Chem. Int. Ed.上，IF=12.257。

研究思路

论文导读

Figure 1. HCy5-Cy7检测多种自由基

HCy5-Cy7在780 nm附近具有来源于Cy7的明显的紫外吸收峰，当与O₂^•-反应后，HCy5-Cy7的结构发生转变，在640 nm处展现出新的吸收峰，而ONOO^-会破坏HCy5-Cy7的骨架，导致780 nm处的吸收峰降低（Figure 1a）。与紫外吸收相比，该探针对O₂^•-和ONOO^-同样具有相似的荧光响应，O₂^•-可以点亮HCy5-Cy7在660 nm处的荧光，而ONOO^-会其在淬灭800 nm处的荧光（Figure 1b）。HCy5-Cy7对不同自由基表现出良好的特异性和优异的灵敏度，根据660 和800 nm处不同的荧光响应模式，可以成功区分不同的ROS和RNS，且对O₂^•-和ONOO^-的检测限（LOD）分别可达到0.34和0.082 μM（Figure 1c-d）。

Figure 2. HCy5-Cy7对多种自由基的检测

以小鼠RAW264.7巨噬细胞为模型，考察HCy5-Cy7监测细胞内源性多种自由基相关性的能力，实验使用phorbol 12-myristate 13-acetate（PMA）和lipopolysaccharide（LPS）/interferon-γ（IFN-γ）/PMA诱导细胞产生过量的O₂^•-和ONOO^-。如Figure 2a所示，在正常条件下ROS和RNS的含量较低，仅能观察到Cy7通道明显的荧光（紫色），几乎观察不到Cy5通道的荧光（红色）。而PMA处理组具有明显的红色荧光，而紫色荧光基本保持不变，表明HCy5-Cy7可以特异性检测细胞内O₂^•-的生成。在使用LPS/IFN-γ/PMA刺激后，Cy5的荧光增强而Cy7的荧光降低，表明该探针可以在细胞内产生的对O₂^•-和ONOO^-进行检测。虽然有研究表明LPS/IFN-γ/PMA刺激的巨噬细胞主要通过激活NADPH氧化酶和一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase, iNOS）诱导ONOO^-上调，但通过细胞刺激实验和RNS清除的实验清楚地证明O₂^•-和ONOO^-在炎症过程中的共存和相互关系，说明了制备的多响应探针HCy5-Cy7可以应用于在复杂动态条件下病理和生理学的研究。此外，HCy5-Cy7探针还能够靶向线粒体，从而使其能够精确监测原位氧化、硝化以及随后由氧化应激诱导的细胞损伤（Figure 2b）。

基于以上结果，分别使用金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）构建细菌感染模型，进一步研究HCy5-Cy7对细菌入侵引起的宿主防御过程中多种自由基的识别。在Figure 2c-d中，分别孵育两种细菌后的巨噬细胞在660 nm处的荧光强度随时间延长而增强，表明在感染过程中有大量的ROS产生，然而在800 nm处只能观察到轻微的荧光变化，这表明RNS可能在细菌感染过程中产生的较少。抗生素处理后，E. coli组中ROS的水平略有上升，对于S. aureus组会引起RNS自由基的少量产生，这表明ROS和RNS自由基在细菌感染和抗生素使用中起着重要作用。

Figure 3. 小鼠细菌感染模型中多种自由基分析

分别在小鼠腹腔内注射S. aureus和E. coli以构建细菌感染模型，尾静脉注射HCy5-Cy7探针，分析细菌感染中多种自由基的变化。与对照组相比，Cy5的荧光显著增强并在细菌注射2 h后达到最大响应，表明了ROS的大量产生，而注射了E. coli的小鼠Cy7的荧光略有下降，这表明在细菌感染的早期可能存在低水平的RNS产生（Figure 3a and c）。在长期感染模型中（5天），Cy5通道展现出明亮的荧光，表明了在长期感染中会发生氧化应激，而在Cy7通道仅观察到微弱的荧光变化，进一步证明在细菌感染过程中的发病机制主要以ROS应激为主（Figure 3b and c）。PCT法（The standard procalcitonin）被用来对小鼠血液样本进行临床炎症诊断，以研究细菌感染状况与氧化应激变化之间的相关性。在长期感染中，血清降钙素原水平呈上升趋势，与荧光变化的结果一致，说明病理过程与氧化应激变化有良好的对应关系（Figure 3d）。由于细菌病理反应相对较弱，因此在短期细菌感染（2 h）中并未见到明显的降钙素原增强。

论文亮点

1. 合成的双发射荧光分子探针HCy5-Cy7分别在660 nm和800 nm处呈现不同荧光。

2. HCy5-Cy7对细胞内的多种自由基具有不同的响应，ROS可以点亮Cy5的荧光，而RNS可以淬灭Cy7的荧光。

3. 利用HCy5-Cy7对自由基的差异性响应，不仅能够对小鼠细菌感染过程中氧化应激和亚硝化应激的进行监测，还可以应用于研究细菌发病过程中RONS与宿主防御反应间复杂的相互作用。

4. 该研究为了解氧化/亚硝化应激与细菌发病机制的内在联系提供了新的视角，有助于当前影像引导的精确医学在防治传染病方面的应用。

文献链接

Zhimin Wang, Thang Do Cong, Wenbin Zhong, Jun Wei Lau, Germain Kwek, Mary B. Chan-Park, Bengang Xing*

Cyanine-Dyad Molecular Probe for Simultaneous Profiling of Multiple Radical Species Evolution in Bacterial Infection, Angew. Chem. Int. Ed., 2021. DOI: 10.1002/anie.202104100.

---

动动小手加星标，浏览文章不迷路！

关注菌菌🍄

每天轻轻松松学生物，幸福喜乐阖家欢~

往期推荐关注我们

点了“在看”的小哥哥小姐姐

永远帅气美丽可爱迷人😗