结缔组织到底该怎么染色？

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结 缔 组 织 染 色

组织学上，结缔组织分为3种，包括致密结缔组织、疏松结缔组织以及网状结缔组织。而结缔组织染色法可以很好的显示出各种纤维，如胶原纤维、网状纤维和弹力纤维，以此展现各种组织病变或修复情况。结缔组织染色最经典的方法是Mallory三色法，其它的染色方法基本都是衍生于它。

Q1：结缔组织三色法染出来到底有啥用？

答：HE无法有效区分胶原纤维，而三色法可将其标记出来，用于病理分析或半定量分析都是可以的。三色法还可以展现各种组织病变或修复情况，如心肌坏死后纤维修复情况；还可以对心内膜弹力纤维增生和心肌纤维化作鉴别诊断。可以为肿瘤相关病变提供病理诊断参考。

Q2：各种染色方法的最佳适用条件？

答：

（1）Mallory三色法：网状纤维、胶原纤维以及碱性物质可被染成深蓝色，而软骨、黏液等被染成浅蓝色；神经胶质、纤维素、肌纤维以及酸性物质被染成粉红色；红细胞、弹力纤维可被染成橘色；最后细胞核被染成黑蓝色。

（2）Cason三色法：是经Mallory三色法改良而来的混合型染料染色法，可将酸性物质染的更深，且操作相对简便。

（3）Masson三色法：也是概念而来，较适用于上皮、甲状腺、肿瘤以及垂体等。

（4）AZAN三色法：除了标记结缔组织外，还可将染胰岛和腺垂体细胞染色。

Q3：想要染出好看的颜色，该怎样选择固定液？

答：Zenker固定液是首先。因为它的穿透性很强，可以很好地固定每一种组织。固定后的组织染色很清晰。但有溶解染色质的缺点。大家可综合考虑。

Q4：已经用甲醛固定了的组织怎么处理呢？

答：如果组织已经在甲醛中固定过，且制作成石蜡切片。没事，在切片完全脱蜡复水后，再浸入Zenker固定液中一晚上(室温就行)，然后流水漂洗，直到切片上的黄色基本消失即可进行染色。

Q5：想看看椎间盘退变，怎么染色？

答：诚然HE染色也是可选的，但是Mallory三色法可以很好地观察椎间盘髓核、软骨终板以及纤维环的病理改变。那么Mallory三色法则提供了较好的对比度，在分辨力上具有优势。染法没啥特殊的，就是要记得在固定后脱钙处理（脱钙液：5%甲酸+5%盐酸+75乙醇混合使用，最终PH调成2.2）。

Q6：神经损伤怎么染色又快又好？

答：常规HE染色不仅耗时，而且神经髓鞘会被溶解。选择Masson染色可以很好地显示神经髓鞘，比较便宜方便。PS：神经组织可用4%甲醛-钙溶液、Zenker固定液、或者Bouin固定液进行固定，可以有效减少神经髓鞘的丢失。Masson染色步骤不细表。

Q7：腺体、垂体如何染色比较好看？

答：常规HE染色，确实能染，但是效果不是很好，染色后组织结构不清晰。上面提到的AZAN三色法除了标记出结缔组织外，还可将染胰岛和腺垂体等染色。最终效果是肾上腺的球状带被标记为蓝色，毛细血管呈橘黄色，束状带内的脂肪也比较清晰。垂体中嗜酸性细胞呈红色，嗜碱性细胞和结缔组织呈蓝色，血细胞则染成橘黄色。这样看来，整个颜色分辨度还是蛮高的。

Q8：网状纤维与免疫组化双染-两开花？

答：同一张肿瘤组织切片上同时染出网状纤维和神经胶质纤维GFAP、以及波形蛋白。网状纤维只能被硝酸银染色，可以选择用常规的Gomori染色法。因此整个过程大致要分两部分。常规脱蜡复水。第一步是银染，0.5%高锰酸钾2min后去离子水漂洗；1%草酸漂白1min后再去离子水漂洗；2.5%铁明矾溶液3min后去离子水漂洗至少2次；氨银溶液20s后快速漂洗，进入1%甲醛中快速还原，然后水洗（配方：3%的氢氧化钠10ml+10%的硝酸银水溶液10ml，+再加几滴氨水）；0.2%氯化金染成金色后漂洗；最后再用5%的硫代硫酸钠中还原，漂洗。第二步是免疫组化染色，无需再进行抗原修复，直接进入3%双氧水孵育5min，然后水洗；再用PBS平衡5min；5%血清封闭，室温下10-15min就行；分贝滴加相应的一抗4℃过夜（抗体得选好，滴度可适当提高），PBS漂洗；接着滴加二抗，可37℃半小时，漂洗干净后进行DAB显色反应。最后水洗干净，采用免疫组化专用苏木素染核、分化、反蓝、水洗。最后就是常规的脱水透明封片了。

PS：此法整个过程较长，且存在多步氧化、还原及水洗过程，操作要轻柔，不然分分钟脱片，欲哭无泪。但是理解好这里面每一步，那么你的氨银染色技术肯定突飞猛进。事实上，氨银染色技术还可以依靠微波、胰蛋白酶以及改变试剂配方等方法加强染色，这就属于高阶了。

Q9：同时显示弹力纤维和脂质？

答：搞血管脂质代谢研究的同志可以试试，大原则就是将油红O染色（配方：油红0.2g+70%乙醇400ml充分混匀后静置，使用时也别晃动）与为维多利亚蓝染色相结合。血管组织要用15%中性甲醛充分固定，再作液氮冷冻冰冻切片，厚度为15微米左右，双蒸水轻轻漂洗；再在70%乙醇中小心漂洗2次；进入油红O中染15min，再用70%乙醇洗干净；在维多利亚蓝中染15min左右；在80%乙醇中分化1min；双蒸水2min小心漂洗后洗去组织周围多余水，用甘油胶封片。

PS：维多利亚蓝染色液如果自己配制，真的很繁琐。建议直接买商品。另外染色时，一定要漂浮染色，可别贴着玻片染。

Q10：弹力纤维+免疫组化=再次开花

答：Gomori染色法可以很好地区分血管内、中、外弹力膜，层次很清晰。然后再加上你想要的免疫组化标记物。这个跟前面刚好反过来了。先常规染免疫组化，再作Gomori染色。免疫组化可以适当地调整：如选择特异性强的一抗，缩短一抗孵育时间至1h，这样就可以在一天内完成了，小编就贴公司名字了。然后就是Gomori染色：上一步结束，切片要漂洗充分并在70%乙醇适当漂洗；接着在醛品红液中染色10-15min左右，用70%乙醇适当漂洗直至不再掉色，然后晾干树胶封片就行。

PS：醛品红配制法：碱性品红0.5g+70%乙醇100ml+浓盐酸1ml+三聚乙醛1ml。碱性品红溶于70%乙醇混匀后，加浓盐酸混匀，再加三聚乙醛混匀，室温静置2天，待醛品红溶液成熟变成深紫色，过滤后4℃冰箱保存。

完结！撒花！

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以上为本期内容，结缔组织到底该怎么染色？

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