生物小白的进阶课——细胞的siRNA转染（节一）

亲爱的粉丝朋友们，感谢你们的持续关注。当你们开始认真阅读这篇教程的时候，就有个好消息跟一个坏消息摆在了你们面前。

好消息是，恭喜你们，你们已经开始从生物的入门实验上毕业了。坏消息嘛，嗯，距离真正成为一个生物研究者，那路还漫长着呢。

    今天，我们要开始干预基因了。

    相信大家看过一段时间的文献，或是跟组上的师兄师姐们交流过后，很快会发现，生物实验中，为了验证某个基因或是某个通路对特定表型的作用，常常需要对这个分子进行正反验证和回复验证。那么，基因的干预便是必不可少的了。siRNA便是一个很常用的用于敲减目的基因的一个工具。详细的介绍，后期小编还会有相应的文章进行介绍。

关于siRNA，目前我们只需要知道这是一个敲减目的基因的工具。我们在NCBI上查询了需要敲减的目的基因的CDS序列或是NM号之后，提供给专业的基因公司，他们便会出一份合同，确认无误后开启项目，用不了多久，一套成品的siRNA就到了我们手上。通常来讲，我们会到手1~2管荧光标记的siRNA（用于摸索转染条件）、3管不同序列的siRNA（他们的目标基因相同，但是敲减效率可能不同，我们需要选出敲减效率最好的一管，当然也有可能3管都不行，那我们还需要跟厂家进一步反馈）、一管siRNA阳性对照、一管siRNA阴性对照。接下来，我们只要好好用好这个工具，就可以了。

    本次教程我们主要的学习资料是siRNA及脂质体（作为我们的转染工具）的说明书。两份说明书，可以通过关注“轲小基的魔药教室”，并回复“siRNA转染”获取。

    下图是我们拿到手的RNA配套的说明书。我们需要关注里面的几个点。

• 用DEPC 水溶解并配制成20μM液体即可直接转染细胞。
• 贮存浓度一般为20μM，溶解后的产品分装保存于-20℃~-80℃。
• 整个实验过程要求无RNA酶环境，所有耗材需要无酶处理。
• 荧光标记的siRNA要求避光。
• 推荐的siRNA转染浓度是50nM，可具体情况优化转染浓度，建议优化的转染梯度为100nM，50nM，20nM，10nM，5nM，1nM。
• 推荐使用RNAiMAX Transfection Reagent（Invitrogen）进行转染。当然，也可以不接受他们的推荐。小编使用的是Lipofectamine 2000（Invitrogen）。两个试剂的价格差别还是比较大的，各课题组可以根据需求和实际经济情况做出相应的选择。

    Lipofectamine 2000的说明书，我们将节选其中需要关注的几个部分进行展示。

    如上图所示，protocal提到了要去血清、去双抗，因为它们会对细胞的转染效果、细胞状态造成影响。

如上图所示，为siRNA转染的protocal。这里有两个点需要关注：

• 它提到了建议使用的转染专用培养基Opti-MEM。这里小编是接受了它的建议，确实除外也没有什么更好的选择。
• 它建议转染4~6个小时之后，更换为完全培养基。这儿建议的比较委婉，用了may这个词。对此，小编还是强烈建议在6h后更换完培，因为转染专用的培养基营养成分较少，时间过长，可能对细胞造成不可挽回的损伤。

完成了这两份说明书的阅读，我们现在已经对转染的整体过程有了大致的了解了。现在我们知道，在进入正式的基因干预之前，我们还有两个重要的预实验要做。一是用荧光标记的siRNA优化转染条件；二是从3管siRNA中挑选敲减效率最高的siRNA序列。

今天的内容暂告一段落，预知后事如何，且听下回分解。

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