体细胞核移植胚胎的表观遗传修饰异常及改善策略

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文│高绍荣 阳玲月

编辑│陈圆圆  

审校│汤红明

高绍荣 教授

现任同济大学生命科学与技术学院院长，教育部“细胞干性与命运编辑”前沿科学中心主任，曾任“干细胞研究”国家重大科学研究计划专家组成员，为国家杰出青年科学基金获得者、教育部“长江学者”特聘教授、“万人计划”领军人才、科技部中青年科技创新领军人才、国家百千万人才工程“有突出贡献中青年专家”、国家重点研发计划干细胞与转化医学重点专项首席科学家。从事哺乳动物早期胚胎发育和体细胞重编程分子机制研究，在Nature、Science、Nature Genetics、Cell Stem Cell、Nature Cell Biology等学术期刊发表论文百余篇。

体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer, SCNT）技术能够将不具有潜在分化能力的体细胞注射进去核卵母细胞后重编程为具有全能性的胚胎，进而形成一个完整的生物体。该技术在濒危物种保护、农业生产和生物医学方面具有重大意义。1997年，英国科学家Ian Wilmut利用SCNT技术首次成功克隆哺乳类动物“多莉”羊；2018年，中国科学家孙强首次成功克隆非人类灵长类物种食蟹猴，引起了全世界的关注。

目前已经有超过20种克隆哺乳动物通过SCNT技术成功获得，但在SCNT技术的实际应用中仍然存在一些亟待解决的问题，主要表现为克隆效率低以及克隆胚胎存在胎盘巨大、肥胖、早期死亡等一系列异常现象。近期的突破性研究表明SCNT胚胎与正常受精胚胎或体外受精（in-vitro-fertilized , IVF）胚胎相比，在表观遗传修饰上存在着缺陷，这可能是长期以来动物克隆胚胎成功率低的主要原因。随着科学技术的日益发展，人为改变克隆胚胎表观遗传修饰异常的方案也日趋完善。

1. 供体细胞转录组激活

供体细胞转录组的充分重编程对于SCNT胚胎的发育非常重要。小鼠SCNT胚胎相比较于IVF胚胎，通常有约20%体细胞相关基因的表达不能被有效抑制，在合子基因组激活（zygotic genome activation，ZGA）阶段有部分基因不能被有效激活，这些表明SCNT胚胎的转录组没有充分重编程。研究发现这些不能被有效沉默或激活的重编程抵抗区域是表观遗传修饰异常所导致的。同济大学高绍荣课题组通过在不同发育阶段对发育正常和异常的SCNT胚胎分别进行转录组测序后，发现发育阻滞的SCNT胚胎与正常受精胚胎相比，有大量表观遗传调控因子和转录因子没有被激活。在进行了各类尝试后发现，过表达表观遗传相关基因Kdm4b可以有效防止克隆胚胎2-cell时期发育阻滞，Kdm5b则可以有效防止4-cell时期发育阻滞；同时过表达Kdm4b和Kdm5b可以将SCNT胚胎的囊胚发育率提高到95%左右。

2. 供体细胞DNA去甲基化

DNA甲基化的异常也是影响SCNT胚胎发育成功率的一大原因。多种克隆动物胚胎存在高水平DNA甲基化，甚至在SCNT胚胎植入后也可检测到异常的DNA甲基化模式。先前有研究使用简并代表性亚硫酸氢盐测序（Reduced representation bisulfite sequencing，RRBS）技术分析第一次卵裂前的SCNT胚胎，确定了长散布序列（long interspersed elements，LINEs）、长末端重复序列（long terminal repeats，LTRs）和20多种基因为去甲基化抵抗区域。美国哈佛大学张毅课题组通过分析小鼠SCNT胚胎囊胚阶段的DNA甲基化组发现Xist等多数重要基因的启动子区域呈高甲基化水平。近期高绍荣课题组的研究发现小鼠SCNT胚胎早期发育过程中还存在异常的DNA再甲基化现象，这导致了一些与ZGA重要相关的基因和逆转座子的错误表达，而使用DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）抑制剂处理可以修复异常的DNA再甲基化，提高SCNT胚胎的发育能力。供体细胞杂合敲除Dnmt1，可明显提高得到SCNT由来的胚胎干细胞的建系效率。此外，也有研究表明Tet3介导的DNA去甲基化同样对于SCNT胚胎的发育至关重要。

3. 改变供体细胞组蛋白修饰水平，促进SCNT胚胎发育

组蛋白共价修饰与基因的转录密切相关。早期研究表明，SCNT胚胎相比较于正常胚胎在初期发育阶段组蛋白甲基化水平偏高，而乙酰化水平则偏低。早在2006年，Kishigami等人使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）曲古抑菌素（TSA）大幅提高克隆效率，目前已知有超过20种HDACi，但仍然无法完全解决克隆胚胎的异常。2014年，张毅课题组研究发现重编程抵抗区域（Reprogramming Resistance Regions，RRRs）上富集了转录抑制标记H3K9me3，影响了ZGA的起始，是SCNT胚胎充分重编程的主要障碍之一。通过体外表达H3K9me3去甲基化酶Kdm4d和使用降低H3K9甲基转移酶的供体细胞核可以显著提高SCNT的效率。高绍荣课题组也在研究中发现：内源的H3K9me3去甲基化酶相关基因Kdm4b的表达对SCNT胚胎的发育非常重要，进一步验证了克隆胚胎中H3K9me3水平过高是SCNT胚胎重编程的一个主要障碍；发现H3K4me3去甲基化酶Kdm5b表达过低会导致小鼠SCNT胚胎在四细胞阶段发生阻滞，表明H3K4me3水平异常也是SCNT胚胎重编程的一个障碍，而H3K27me3印记缺失同样也是SCNT重编程的一个主要障碍，会导致小鼠SCNT植入后胚胎的发育阻滞。

4. 改善克隆胚胎植入后的发育能力

克隆胚胎植入后发育能力低下是目前已知的最主要的发育异常阶段之一。2010年，日本RIKEN的Inoue等人通过比较单个SCNT胚胎与IVF获得的正常胚胎的转录组，发现许多X染色体连锁基因在SCNT胚胎中被特异性地持续抑制表达，且与性别无关。这项研究建立了SCNT胚胎和X染色体失活之间的联系。在正常胚胎中，X染色体失活是一种雌性特异的剂量补偿机制，是由X染色体连锁的父源等位基因非编码RNA Xist控制的，Xist几乎覆盖整条X染色体并介导建立抑制性组蛋白修饰H3K27me3，进而使得整条X染色体异染色质化。在一些发育异常的SCNT胚胎中母源和父源两条X染色体无法正确失活其中一条，因此科研人员通过敲除或敲低使X染色体失活过程起重要作用的Xist基因，使得克隆小鼠的制备成功率超过了10%。这些研究都为进一步提高SCNT胚胎克隆成功率提供了新的思路。

5. 展望

通过科研人员多年的探索，体细胞核移植胚胎发育效率低下的部分关键原因已被揭示。通过人为调控DNA甲基化、组蛋白甲基化和乙酰化以及X染色体失活，克隆小鼠的出生率已经逐步攀升，超过了20%，但是与正常受精相比，仍然有着相当巨大的差距，科研人员需进一步结合微量组学和高通量数据分析，深入探究更多的SCNT胚胎表观遗传调控异常的原因，为该技术在各个领域的推广和发展提供理论基础，寻找解开SCNT胚胎发育水平低下的“生物密码”。

（本文来源于《医学参考报》干细胞与再生医学频道2019-04期第1版文章，ID: yxckbsc2019040101。图片来源于网络，如有侵权，请联系删除。）

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