基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术在人多能干细胞研究中的应用

撰文│娄艳茹

编辑│陈圆圆

审校│汤红明

Cas9 mRNA与其他mRNA的体内递送系统在治疗领域有着广泛应用，已被用于人类疾病动物模型的治疗。2020年底，mRNA新冠疫苗也成功进入临床。这些都意味着mRNA在生物医学领域有着广阔的应用前景。

基因编辑是指对目标基因组进行修饰，以改变其基因序列，实现定点突变、插入或敲除的技术。在生物学研究中，精确地改变人类基因组序列对研究基因功能和转录调控具有重要意义。现有的基因编辑技术有转录激活物样效应核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）技术、锌指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）技术以及CRISPR/Cas9核酸酶技术等。较前两者而言，CRISPR/Cas9核酸酶技术设计简便、成本低、效率高，因此广泛应用于多种模型系统中。

一、基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术

编码CRISPR组分的位点首先是在细菌中被发现的。这些组分作为基因组防御机制的一部分，能够检测和消灭外源DNA。Cas9属于Ⅱ型CRISPR/Cas系统，是一种催化DNA双链断裂的核酸内切酶，其切割位点的特异性由包含在相关CRISPR RNA（associated CRISPR RNA，crRNA）转录物中的20个核苷酸指导序列决定。crRNA与反式激活crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）的序列互补，形成crRNA:tracrRNA双链体（duplex），介导Cas9对位点特异性DNA的识别和切割。

目前，这个crRNA:tracrRNA双链体已被人为地重新设计成一个单一的转录本，如单导向RNA（single-guide RNA）或导向RNA嵌合体（guide RNA chimera），具有crRNA:tracrRNA双链体的必要特征，可与Cas9结合，并识别DNA靶点。单导向RNA或crRNA:tracrRNA双链体可以通过酶促反应或化学合成生成。化学合成的一个优点是快速转换和精确生成具有可变序列和长度的短RNA。Cas9协同crRNA:tracrRNA双链体进入细胞后，可根据导向RNA序列和NGG-PAM序列在特定基因组位点产生双链断裂。真核细胞中的双链断裂最终由非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）过程修复。NHEJ非常容易出错，因此可以利用它产生缺失和/或插入（统称为indels），从而破坏内源性靶序列。

基于上述原因，CRISPR最广泛的应用之一是敲除细胞中的特定基因以检测基因功能。然而，需要对条件进行广泛的优化，以实现高效的CRISPR敲除并排除脱靶效应。

Cas9蛋白是一种大蛋白质，根据它们的亚家族分类，它包含大约1,100~1,400个氨基酸。常见的一种Cas9 mRNA是来自化脓性链球菌Ⅱ型（Streptococcus pyogenes Type II）CRISPR/Cas系统，包含多达4,000个核苷酸。Cas9蛋白在细胞中的表达可以通过递送Cas9 DNA、mRNA或蛋白质来实现。Cas9 DNA和蛋白质的递送理论上比mRNA更具挑战性，因为Cas9质粒或Cas9核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）必须穿过两道屏障（细胞膜和核膜）才能发挥功能，而Cas9 mRNA只需穿过细胞膜即可发挥功能。

二、CRISPR/Cas9技术在人多能干细胞中的应用

CRISPR技术已经广泛应用于小鼠胚胎干细胞和许多模式生物的体细胞。然而，在难以操纵的人多能干细胞（human pluripotent stem cells，hPSCs）中，其基因编辑的效率非常低。比如在一个转录活跃的位点AAVS1中，DNA质粒递送Cas9转基因和单导向RNA只有2%到4%的NHEJ事件（包括单等位基因和双等位基因突变）。

通过使用抗生素筛选或流式细胞术来富集瞬时表达Cas9质粒的细胞的方法可以使NHEJ介导的靶向事件增强到50%或更多。然而，双等位基因的靶向效率仅为10%~20%。为了提高双等位基因的靶向效率，科学家们构建了具有诱导性或组成性Cas9表达的细胞株，根据基因靶点的不同，它们产生的双等位基因敲除（NHEJ介导的）效率在20%~60%。然而，这种方法需要产生可诱导Cas9的hPSCs。这种将Cas9序列永久性地并入人类基因组和Cas9的潜在泄漏表达可能导致未知的基因组编辑。

另一种方法是通过脂质体介导的转染或电穿孔递送Cas9核糖核蛋白，但编辑hPSCs的效率（包括单等位基因和双等位基因突变）并没有提高。GeneArt™ Platinum™的Cas9核酸酶相对来说编辑效率较高，在单个基因位点中产生基因突变的效率可达24%（包括单等位基因和双等位基因突变）。最近的一项研究发现，通过电穿孔将Cas9核糖核蛋白和化学修饰的导向RNA递送到hPSCs，并延迟递送腺病毒供体模板，可产生高效的同源性定向修复率（根据位点的不同，双等位基因靶向效率在10%~74%不等）。然而这种方法导致的脱靶频率高达90%。使用高保真Cas9蛋白虽然在一定程度上减少了脱靶事件，但牺牲了双等位基因的靶向效率（从76%降低到20%），且大多突变为单等位基因突变。

有人尝试将Cas9 mRNA递送到小鼠受精卵和其他胚胎中并产生了有效的编辑。例如，脂质纳米粒中携带的Cas9 mRNA系统递送纠正了Fah基因的突变（缓解了遗传性酪氨酸血症小鼠模型中的疾病症状），以及诱导家族性高胆固醇血症靶点Pcsk9基因突变。体外转录的导向RNA的转染比电穿孔的导向RNA质粒产生更高的编辑效率（~30% VS 0%）。有研究试图用Cas9 mRNA编辑hPSCs 中的Emx1基因位点，但通过半定量T7核酸内切酶分析所检测的编辑效率极低。这种不成功的编辑可能是由于在向hPSCs递送Cas9 mRNA等大mRNA物种时所用的常规转染方案效率低下。

如上所述，CRISPR/Cas9介导的hPSCs基因组编辑的常用方法主要使用质粒或核糖核蛋白复合物。基于质粒的基因组编辑方法会有外源基因整合的风险，并且双等位基因靶向效率具有不确定性。基于核糖核蛋白复合物的基因组编辑方法需要使用诸如电穿孔之类的递送方法，可能导致细胞死亡。

三、基于Cas9 mRNAs的基因编辑技术在hPSCs中的应用

理论上，在单细胞悬液中转染Cas9 mRNAs和crRNA:tracrRNA双链体，可使细胞表面与转染试剂的接触面积最大化，从而提高hPSCs中的转染效率。若结合抗性基因筛选，靶向效率或可进一步提高。此外，由于crRNA:tracrRNA双链体在细胞内容易降解，只有与Cas9蛋白结合才会更稳定，因此递送crRNA:tracrRNA双链体的时机也需进行优化（有足够的时间让Cas9 mRNA在细胞内翻译成Cas9蛋白）。

根据上述分析，复旦大学药学院娄艳茹课题组建立了一种基于Cas9 mRNA的递送平台，通过使用抗生素选择和交错递送Cas9 mRNAs和crRNA:tracrRNA双链体的策略，将其对于hPSCs的基因编辑效率提高到85%，双等位基因突变效率达到30%~70%，大大高于质粒的方法，与Cas9核糖核蛋白及化学修饰的导向RNA分子相比也具有一定优势。目前的数据证明，利用体外转录的Cas9 mRNAs和化学合成的crRNA:tracrRNA双链体通过脂质转染在hPSCs中能够有效地进行CRISPR介导的基因组编辑，并且与使用Cas9核糖核蛋白一样，也可以产生无外源基因整合的、可用于治疗的细胞，但该方法有待进一步优化。

四、基于mRNAs的基因编辑技术的展望

对于疾病建模，娄艳茹课题组的方法可用于构建特殊的细胞株。最后，由于该方法是无外源基因整合的，可以很容易地应用于基因编辑生成患者的hPSCs或“off-the-shelf”的hPSCs。

Cas9 mRNA与其他mRNA的体内递送系统在治疗领域有着广泛应用，如在脂质纳米粒或其他生物相容性制剂的辅助下，Cas9和其他mRNAs的系统递送或局部给药已被用于人类疾病动物模型（如心肌梗死、心脏损伤以及其他先天遗传错误，如因子Ⅸ缺乏症、甲基丙二酸血症、家族性高胆固醇血症和遗传性酪氨酸血症等）的治疗。在体外研究中，体外合成的mRNA递送系统已被用于卵巢癌的小鼠实体瘤模型的CAR-T细胞治疗中。mRNA转染已被用于诱导hPSCs的分化，并可将成年体细胞重新编程为hPSCs。2020年底，mRNA新冠疫苗也成功进入临床。这些都意味着mRNA在生物医学领域有着广阔的应用前景。

专家简介 PROFILE

娄艳茹

复旦大学药学院研究员

博士生导师

长期从事人多能干细胞、类器官、组织工程、生物材料、再生医学、基因组编辑等领域的科研，负责研发的用于人多能干细胞三维培养的纳米微纤纤维素水凝胶获世界多国专利并已开发为商业产品。主持多项芬兰科学院、芬兰国家教育局、芬欧汇川公司项目，共计超过116万欧元。获授权发明专利9项，发表SCI论文44篇，H-index23。

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