间充质干细胞产品效价分析方法的建立

撰文│廖联明

编辑│毕紫娟

审校│汤红明

转载需获取授权，请后台与小编联系

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）进入临床应用已有20多年。MSC可迁移至受损组织，通过多种机制促进损伤组织再生和愈合。MSC分泌的活性物质可激活组织修复过程，抑制免疫反应和炎症。MSC除了有很好的治疗效果之外，还可以进行大规模体外扩增， 且不需要进行HLA配型，这些特性促使MSC成为在细胞治疗领域最广泛使用的细胞类型。MSC在治疗退行性、炎症性和免疫性疾病上有巨大潜力和商业价值。目前已经有多个产品获批上市，但仍有大量候选产品处于临床前和临床研究阶段。

在任何生物制品研发阶段，建立稳定、合理的效价测定方法不仅是药监部门的要求，更是保证产品质量、有效的基础。在MSC产品的研发过程，制定恰当的效价测定方法至关重要，因为不同研究者的MSC组织来源（例如骨髓、脂肪组织、脐带和胎盘）和培养方法也不相同，即使它们具有相同的形态、细胞表面标志物和分化特征，其生物学功能属性仍然可能存在重大差异。2006年国际细胞治疗协会制定了MSC最低标准，其中包括表达一组特定细胞表面蛋白（CD）和三系分化能力。尽管不同研究者的MSC产品符合这些标准，但它们是不同功能的多样化细胞群。因此，必须通过效价测定以保证产品质量。按照作用机制建立的效价测定方法还可为研究人员和监管机构对比不同临床试验中的MSC疗效提供数据。就此而言，效价测定是确定细胞产品在一定剂量下发挥预期效果的重要指标，即效价测定是确保生产的一致性及接受细胞产品治疗患者获益的重要手段。

在美国体外培养扩增的MSC产品按照美国《公共卫生服务法案》作为新药进行管理。如果MSC进入临床研究并打算上市，FDA会将效价测定作为产品放行标准的一部分。FDA发布了细胞和基因治疗（CGT）产品效价检测方法的开发指南，（http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/default.htm）， 虽然这个指南很有参考价值，但是并没有推荐任何具体的效价测定方法，也没有提出产品放行标准，因为效价测定方法取决于具体产品。

根据美国联邦法规（21CFR 600.3）规定，效价指“通过恰当实验检测方法或预期给药方式下进行的、有充分临床试验数据显示，能够产生某种疗效的特定产品功能”。虽然FDA没有提供任何关于特定类型产品的效价检测方法，但是FDA要求所有效价分析必须遵守以下规则：

1

明确每个产品的效价（生物学活性）

2

具体产品放行标准

3

是定量数

4

验收和（或）拒收标准

5

包括适当参照品、标准品和/ 或对照品

6

建立检测方法的精确性、灵敏度、特异性和重复性，并通过验证

7

所有有效成分的鉴定方法和活性

8

提供确定产品有效期的数据

建立效价测定方法对细胞产品研发人员是一个挑战，但这是保证临床研究产品质量、纯度、效价和稳定性可靠的主要手段。

开发效价测定方法有许多步骤，最主要的是明确产品将用于治疗疾病的生理病理学特点和细胞产品的潜在作用机制。虽然已对MSC在各种疾病中的应用进行了大量临床前和临床研究，但业界对MSC的效价测定方法还没有达成共识，主要原因是MSC作用机制广泛，这也最终决定了MSC临床疗效产品属性较多。因此，研究者应确定哪些产品属性与目标适应证的临床疗效最相关。随着产品作用机制的不断研究，细胞产品早期阶段开发的效价分析方法可能在临床研究的后期被更改。

评估细胞产品效价的常见方法是定量生物检定法，即测定其产生给定疗效的有关产品活性。生物检定法包括体内动物实验，体外器官、组织或细胞试验，以及这些试验的不同组合。在生物检定法不可行或不实用的情况下可采用非生物分析法替代，为此需要建立替代测量方法和生物活性之间的相关性。替代测量方法必须建立在临床前/ 概念验证研究数据、临床研究数据的基础上。如果替代测量方法获得的产品属性数据可以通过产品的生物活性相互证实，这些属性就可作为产品效价的指标。

因为MSC具有复杂的作用机制，具有多种活性成分和相应的生物活性，针对某个适应证单一的生物学或分析检测方法不足以充分体现MSC效价。因此，开发多种互补检测方法以测量不同产品属性更能够体现产品的效价值，这种分析方法组合包括不同的生物法和分析法。

以美国Athersys公司的MSC产品（MAPC，商品名为MultiStem）的效价检测方法为例，MultiStem的用途之一是治疗心肌梗塞和下肢缺血。该公司首先证明了MAPC分泌的CXCL5、IL-8和VEGF与产品体外促血管生成相关。如图1所示，当从条件培养液（CM）中分别用抗体中和VEGF、IL-8和CXCL5时，CM促进体外血管内皮细胞形成小管能力下降，说明VEGF、IL-8和CXCL5是主要活性成分。进一步研究发现，单独IL-8和CXCL5无促血管生成作用。因此，3个指标联合检测最能反映MAPC的活性，可将每批产品中CXCL5、IL-8和VEGF的分泌能力作为MultiStem产品血管生成效价指标。

图1 间充质干细胞条件培养液（CM）的促血管生长活性。CM可以促进体外微小血管的形成（CM 组）。但当分别用抗体中和CM中的VEGF（CM-VEGF 组）、IL-8（CM- IL-8 组）和CXCL5（CM-CXCL5 组）后，CM促进微小血管形成的效价下降

随后，该公司研究了这3个因子在其他2个因子存在下体外刺激小管形成的最低浓度，并将这些浓度作为终产品的放行标准。如图2所示，促进小管形成需要加入的最低VEGF、CXCL5和IL-8浓度分别是25pg/ml、2000 pg/ml和80pg/ml。考虑到CM中3个因子的本底值，最后制定的VEGF、CXCL5和IL-8浓度标准分别是34pg/ml、2051pg/ml和112pg/ml。

图2 不同浓度VEGF、CXCL5和IL-8体外促进微血管形成的影响。VEGF、CXCL5和IL-8体外促进微血管形成的最低浓度分别是25pg/ml、2000pg/ml和80pg/ml

进一步研究表明，在连续4 个批次细胞中，培养液中这三个因子的浓度非常稳定，适合作为效价指标。
该效价测定方法采用细胞上清液作为测定目标，作为质控可贯穿于生产过程，同时可作为终产品放行标准。
除蛋白因子外，其他效价指标包括定量的全部或部分基因表达谱。无论选择哪种效价分析方法，开发效价测定方法都必须包括适当对照品和特异性参考物质。对照品的应用可确保效价测定在给定范围内进行，结果可靠。因为效价测定将作为放行标准，而细胞的保存时间可能很短，所以需要考虑检测方法的简便性。此外，验证效价分析方法必须满足特定要求，包括准确性、精密度、重复性、特异性、灵敏度、线性和范围、系统适用性和耐用性。 （ ID：yxckbsc2021060301）

作者简介

廖联明 研究员

      福建医科大学协和医院中心实验室研究员。主要从事间充质干细胞临床应用和造血干细胞分化研究，为中华医学会医学工程学分会干细胞工程专业委员会委员，《中华细胞与干细胞杂志》《中国临床药理学杂志》和Vascular Investigation and Therapy杂志编委。在Diabetes、JAMA、J Clin Oncol 、Cytotherapy等杂志发表多篇干细胞的临床应用研究论文。—  END  — 
《医学参考报》干细胞与再生医学专刊   由同济大学附属东方医院承办感谢大家的支持！

扫码关注

征稿链接

相关推荐

间充质干细胞治疗（四）：效力评价