ALI/ARDS间充质干细胞的临床应用

撰文│朱    峰   马少林

编辑│毕紫娟

审校│汤红明

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急性肺损伤（Acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory distress syndrome，ARDS）是临床常见急危重症，其主要病理改变为肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞受损，通透性增加，富含蛋白质的液体渗出积聚于肺间质和肺泡。目前对ALI/ARDS的治疗以支持治疗为主，包括机械通气和药物治疗，其临床病死率近40%，甚至更高。随着干细胞生物学和工程学的发展，人们逐步认识到间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）具有“归巢”至损伤组织，在目标组织中抑制免疫及炎症反应，向多种组织细胞分化而不涉及伦理道德问题的特征，且易于分离培养和外源基因的导入、表达，免疫原性低，遗传背景稳定等特点，这使其在创伤修复、组织功能再生与重建、免疫调节和治疗等领域有着极广阔的应用前景，其机制见图1。自20世纪80~90 年代，MSCs在ALI/ARDS中的基础研究和临床试验越来越多，这次席卷全球的COVID-19将ALI/ARDS的MSCs 临床安全性和有效性的研究推向新高峰，可能为ALI/ARDS的治疗开辟新途径。

图1 各种来源MSCs治疗ALI/ARDS的可能机

一、临床前研究

1. MSCs肺内“归巢”（homing）及机制

多个早期研究显示，MSCs可“归巢”至各种原因所致肺损伤和炎症区域，这是干细胞发挥功能的前提。肺损伤后，坏死细胞可通过释放一系列信号因子，引导表达特异性受体的干细胞移动并黏附于损伤处，这被认为是干细胞“归巢”的主要机制。损伤引起干细胞动员和归巢的信号因子主要包括：基质细胞衍生因子-1及其受体CXCR4、受体c-kit、集落刺激因子、血管内皮生长因子和整合素等，大量细胞因子、蛋白水解酶及黏附分子等可能也参与此过程。

2. MSCs肺内分化及其机制

研究证实， 多种来源的MSCs在体内体外可转化为Ⅰ型、Ⅱ型肺泡上皮细胞，并表达肺表面活性物质相关蛋白C。笔者在用骨髓MSCs治疗吸入性损伤兔时发现，标记的骨髓MSCs能分化为Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞及肺血管内皮细胞，并表达它们的细胞标记物。目前对MSCs分化、修复损伤肺组织的具体机制不明确，可能是一个或多个机制共同作用的结果。研究提示，这种分化高度依赖外界环境信号和细胞内信号传递。Wnt信号通路、细胞内Ca²⁺ 通道、丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）信号，以及Rho信号通路等均可能参与了MSCs体内外的增殖与分化。

3. MSCs肺内及全身抗炎-免疫调节作用及其机制

现有理论认为，ALI/ARDS的实质是炎性反应和毛细血管通透性增加的综合征，充斥大量促炎、抗炎及免疫调节反应。各种原因引起炎性细胞激活和一系列炎性介质释放，造成机体损伤，同时激活更多炎性细胞，释放更多炎性介质或细胞因子，使机体受损的信号进一步放大和加强，形成炎症瀑布效应。最近大量研究证实MSCs可防止LPS所致的肺水肿，减轻中性粒细胞在肺内浸润，明显降低血浆前炎因子水平， 如IL-1β、IFN-γ、MIP-1α，保持抗炎因子IL-10和G-CSF水平的稳定， 促使G-CSF急性升高。有研究证实通过肺内给予实验鼠内毒素造成ALI 后4h再向肺内直接给予MSCs，可改善实验鼠48h生存率，减少肺水和支气管肺泡灌洗液蛋白含量，降低肺衬液内MIP-1水平， 升高血浆和肺衬液内的IL-10水平。国内有将MSCs经静脉移植ALI大鼠体内，发现MSCs移植可降低内毒素肺损伤大鼠血浆TNF-α及IL-6水平，降低肺湿/ 干重比值、髓过氧化酶活性，减轻肺泡炎症损伤。

MSCs在ALI/ARDS中的抗炎及免疫调节作用的可能机制有：① MSCs表面表达大量受体分子， 包括CD分子、ICAM-1、VCAM-1、IL-6等多种黏附分子的膜受体，多种整合素亚单位、CXC趋化因子；可分泌细胞外基质蛋白、层粘连蛋白、波形蛋白、骨连接素等。ALI/ARDS时， 这些信号分子直接或间接吸附并中和机体释放的大量炎症因子，降低或改善炎症反应。② MSCs通过产生可溶性细胞因子IL-Ira等诱导T辅助淋巴细胞2（TH2）型对内毒素的促炎反应和抗炎反应，改变炎症因子对LPS的反应方式，使TH1反应降低，维持TH2炎症因子水平，因此可下调LPS的促炎反应和促炎因子，上调抗炎因子。③ MSCs释放某些活性分子， 包括M-CSF、IL-6/7/8/11/12/14/15 等，阻断炎症信号瀑布效应，为肺内功能细胞的修复和再生创造环境。④ MSCs抑制免疫细胞增殖、活化，因子的分泌及诱导T细胞凋亡。

4. MSCs旁分泌作用

这些旁分泌因子通过组织间隙作用于周围细胞，发挥重要的旁分泌作用，广泛参与免疫调节、细胞增殖、凋亡、内源性前体细胞再生、血管再生及释放生长因子以改变内皮细胞或上皮细胞损伤反应。MSCs旁分泌物质可能有：①生长因子及受体，包括血管生成素-1/2、VEGF、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子-β等在内的多种生长因子。②细胞因子和趋化因子， 包括IL-1、IL-6、IL-10及单核细胞集落刺激因子、单核细胞趋化蛋白-1等。③调节肽及其他一些相关分子，包括钠尿肽、降钙素基因相关肽、局部肾素- 血管紧张素系统、内皮素和肾上腺髓质素等在内的多种调节肽和一些特异性活性因子，包括干细胞因子、干细胞衍生因子、干细胞衍生的神经干/祖细胞支持因子等。这些干细胞旁分泌物质在ALI/ARDS 的治疗中发挥重要作用，具体表现在：抗炎和免疫调节，清除肺泡液，修复和改善受损的肺泡毛细血管屏障结构和功能，趋化其他细胞参与组织修复，抗菌作用，促进血管生成，抗凋亡，促代谢，防御反应和组织分化等。

5. 线粒体转移

外源性MSCs可将具有正常功能的线粒体转移“捐献”至损伤肺组织细胞和气道上皮细胞并重建其功能，转移至局部肺泡细胞的线粒体增加了局部和邻近肺泡细胞的ATP含量及Ⅱ型肺泡上皮细胞表面活性物质分泌，是干细胞治疗肺损伤的重要机制之一。线粒体转移需通过细胞间形成的间隙链接通道（GJCs）实现。线粒体转移的具体机制有以下几种假说：①在受体细胞及供体细胞间形成隧道纳米管，主动转运完整线粒体。②转移线粒体DNA而非完整线粒体。③受体细胞被动吞噬干细胞出芽产生的含线粒体的微泡。④细胞完整融合后选择性丢失供体细胞核。线粒体转移不会发生在未遭受LPS等外界攻击的正常肺，说明对肺泡上皮组织的病理性刺激才是线粒体转移的关键。线粒体转移具有单向性，即从外源性干细胞转移至受损呼吸道细胞。多项研究证实线粒体转移的单向性可能与连接管道结构内微泡中的细胞骨架微丝有关。

6. MSCs胞外囊泡

根据国际细胞外囊泡学会（ISEV）2018年发布的最新定义，细胞外囊泡为从细胞中自然释放的颗粒，根据大小、密度、表征分不同亚型， 包括凋亡小体、微囊泡及外泌体。MSCs来源的外泌体是研究较多的胞外囊泡，携带蛋白质、脂质、核酸等，传递给受体细胞，在生理病理调节中发挥组织修复、趋化、抗炎- 免疫调节、转移线粒体等作用。大量研究证实，在ALI/ARDS中，MSCs来源的外泌体在肺内局部和全身进行炎症- 免疫调节，诱导巨噬细胞极化，调节自噬、清除，增强免疫反应功能的内源性外泌体，减少细胞凋亡，减轻缺血/再灌注损伤，降低肺泡表面通透性，改善氧化应激损伤和肺纤维化等。

二、临床研究与应用

截至2021年8月20日，以“MSCs”和“ALI/ARDS”为主题词搜索，在ClinicalTrials.gov 注册的有42项临床试验，其中超过26项是涉及MSCs治疗COVID-19安全性/有效性的临床试验。此外，在中国临床注册中心（https://www.chictr.org.cn）注册的关于MSCs 治疗COVID-19的临床试验已有15项。在ALI/ARDS和COVID-19患者中注册基于MSCs的临床试验的国家和数量正逐步增加，目前数量最多的是中国和美国。

第一项MSCs治疗ALI/ARDS的临床试验是在中国进行（NCT01902082）。这是一项Ⅰ期、单中心、随机、双盲、安慰剂对照临床试验，ARDS患者静脉注射异体脂肪来源的MSCs（1×10⁶/kg）。给药患者安全且耐受良好。在I 期安慰剂对照研究中，两组之间没有与输注细胞相关的不良反应或严重不良事件报道，治疗后28天住院时间、脱机天数相似。MSCs组第5天血清SP-D水平明显降低。第二项I期临床试验（START）在美国进行，是一项多中心、开放、剂量递增、1期临床试验（NCT017775774），对象是中- 重度ARDS患者。进行单次静脉注射异体骨髓MSCs（1×10⁶/kg，5×10⁶/kg和10×10⁶/kg），未观察到呼吸不良反应，氧合指数改善，血浆ANG-2水平降低，表明干细胞减轻了内皮损伤。在一项后续研究中（NCT02097641），对2例严重难治性ARDS患者的免疫调节和蛋白质组学特征进行了详细分析。2例患者均为2×10⁶/kg治疗剂量，患者呼吸、血流动力学和多器官衰竭均有改善。与此同时，各种肺和全身炎症标志物，包括上皮细胞凋亡、肺泡毛细血管液渗漏、促炎因子和趋化因子有所下降。笔者团队开展的脐带间充质干细胞注射剂治疗吸入性肺损伤的随机、双盲、单中心、安慰剂平行对照临床研究（ChiCTR1900020919）目前所招募的患者初步结果显示安全性良好。

近年，由于COVID-19的蔓延和肆虐，使得干细胞治疗再次被高度关注。根据国际干细胞研究学会的数据，目前还没有被批准的干细胞疗法治疗COVID-19。但基于MSCs已确定为一种能够控制“细胞因子风暴”和放大免疫反应的治疗选择，以及来自不同器官或供体MSCs的ACE2和TMPRSS2呈阴性（这表明MSCs不易被COVID-19感染），干细胞和再生医学已经将MSCs作为治疗COVID-19的有效方法之一。

一项早期研究表明，人MSCs治疗对1例65岁罹患COVID-19危重患者的免疫反应和组织损伤修复的安全有效性。UC-MSCs静脉注射3次（50×10⁶/次，3天/次），第二次UC-MSC给药后，实验室参数和生命体征明显恢复。此后，白细胞和中性粒细胞计数下降至标准水平，淋巴细胞数量增至正常值。另一项涉及7例COVID-19患者（1例出现严重危重类型，4例出现严重类型）研究中，接受静脉注射1×10⁶/kg MSCs，单次注射MSCs后未见明显不良反应；接受MSCs 注射的患者在输注后2~4天，临床和分析终点有所改善，病毒滴度降低。这项研究提示COVID-19患者注射MSCs后有较强抗炎作用，这导致了白细胞和中性粒细胞计数减少，C反应蛋白下降了10倍，免疫细胞数和TNF-α水平下降；相比之下，外周血中淋巴细胞、调节性树突状细胞数量和IL-10水平增加。

三、展望

从大量基础研究和有限临床试验结果看出，MSCs治疗各种原因引起的ALI/ARDS安全性良好，对改善症状和恢复肺功能具有一定效果，是ALI/ARDS极具前景的治疗措施。然而，MSCs 治疗ALI/ARDS也有诸多临床问题需解决，比如MSCs最佳治疗剂量，MSCs最有效给予途径及成瘤效应等远期副作用。目前临床试验大多处于1~2期，MSCs治疗ALI/ARDS的科学性、合理性需要更多数据和结果的支持。 

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