新版PROTAC技术，成功降解PD-L1
PROTACs及其相关的靶向降解技术（如LYTACs、dTAGs、Trim-Away和SNIPERs）已经成为靶向传统上被认为不可成药的蛋白的新型治疗方式。
PROTACs全称为Proteolysis-Targeting Chimeras，即蛋白水解靶向嵌合体，是一种由E3连接酶结合物（binder）、Linker以及靶蛋白结合物（binder）组成的异双功能分子，可利用细胞的蛋白降解机制选择性降解靶蛋白。
具体来说，PROTACs分子的一端与靶蛋白结合，另一端与E3泛素连接酶结合。而E3泛素连接酶可通过将一种叫做泛素的小蛋白贴在靶蛋白上将其标记为缺陷或受损蛋白。之后，细胞的蛋白粉碎机（即，蛋白酶体）会降解被标记的靶蛋白。2004年，来自以色列和美国的三位科学家曾因发现“泛素介导的这种蛋白质降解过程”获诺贝尔化学奖。
PROTACs技术最大的优势之一是能够使靶点从“无成药性”变成“有成药性”。传统的小分子抑制剂需要与靶蛋白有很强的结合，通常是与活性位点结合，然而，据估计，人类细胞中80%的蛋白缺乏这样的位点。由于PROTACs只需要与目标蛋白弱结合就可以特异性地“标记”它，因此，目前蛋白质组中~80%不可成药的蛋白可能都能够用PROTACs技术来解决。此外，PROTACs还具有解决传统小分子抑制剂耐药性的潜力，因为基于PROTACs技术开发的蛋白降解剂可能能够催化多种突变蛋白的降解，从而在一定程度上克服或减少耐药性的产生。
尽管基于这些优势，PROTACs具有很大的前景，但这一技术也有一些局限需要克服。由于泛素介导的降解途径发生在细胞内，因此小分子PROTACs目前主要攻击细胞内的靶点，这使得许多膜蛋白（占编码蛋白的∼23%）无法被PROTACs技术靶向，因为这类蛋白在胞内段并无合适的结合口袋供小分子配体结合。因此，一种降解细胞表面蛋白的新策略可能能够使靶向蛋白降解领域产生变革。
近日，发表在Journal of the American Chemical Society杂志上的一项研究中，来自加州大学旧金山分校的一个科学家小组提出，基于抗体的PROTACs（antibody-based PROTACs, AbTACs）或许是一个值得探索的方向。他们的研究报道了一款可招募膜结合E3连接酶来降解细胞表面蛋白的完全重组的双特异性抗体。研究显示，AbTACs能够通过招募膜结合E3连接酶RNF43降解PD-L1。
RNF43是一种跨膜E3连接酶，包括一个有特定结构的胞外域，以及一个胞内RING结构域。RNF43可通过泛素化Wnt共受体Frizzled导致其内吞和降解，进而负调控Wnt信号通路（先前开发的小分子PROTACs都是使用胞质E3连接酶，这项研究扩大了跨膜E3连接酶在靶向降解方面的应用）。
研究中，科学家们选择PD-L1作为初始降解靶点。PD-L1是一种在许多癌症中过表达的蛋白，通过与T细胞上的抑制性受体PD-1结合而导致T细胞反应的抑制。PD-L1有一个小的31个氨基酸长的胞质域（cytoplasmic domain），但没有已知的能够与该结构域结合的小分子配体，这使得用传统的小分子PROTACs来靶向PD-L1具有挑战性。
为了构建PD-L1靶向AbTACs，该研究中使用了已获批上市的PD-L1抗体阿替利珠单抗（atezolizumab）作为PD-L1结合物（binder），然后与RNF43结合物（binder）融合，生成了重组双特异性抗体AC-1。BLI试验证实，AC-1能够同时结合PD-L1和RNF43。
接下来，研究者们试图测试AC-1是否能够降解细胞上的PD-L1。由于PD-L1的高表达，他们首先选择了三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231。流式细胞术证实MDA-MB-231中存在RNF43。研究显示，用10 nM AC-1处理MDA-MB-231细胞可12 h内诱导两种形式的PD-L1大量降解，24 h时降解达到最高水平（Dmax=63%）。
为了测试AC-1对PD-L1的降解是否依赖于RNF43，研究者们使用CRISPR干扰(CRISPRi)敲除了MDA-MB-231细胞中的RNF43。结果显示，用10 nM AC-1处理24 h后，这一AbTACs并未诱导这些RNF43敲除细胞中PD-L1的降解。
为了评估降解途径，研究用bafilomycin（一种溶酶体酸化抑制剂）或MG-132（一种蛋白酶体抑制剂）进行预处理。结果显示，bafilomycin可减轻PD-L1的降解，而MG-132则不能。这些数据表明AC-1以RNF43和溶酶体依赖的方式诱导PD-L1的降解。
最后，科学家们还测试了AC-1是否能在其它细胞系中降解PD-L1，包括三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231、非小细胞肺癌细胞系HCC827和晚期膀胱癌细胞系T24。结果显示，在每个细胞系中，10 nM AC-1处理24 h后均可诱导PD-L1降解，表明这种基于抗体的PROTACs技术具有广泛的细胞适用性。
研究者们认为，AbTACs代表了一种全新的蛋白降解剂技术，值得进一步探索其降解膜蛋白的潜力。
在论文中，他们还重点讨论了另一种依赖溶酶体降解途径、可用于降解膜蛋白的新型蛋白降解技术LYTACs。
LYTACs全称为lysosome-targeting chimaeras，即溶酶体靶向嵌合体，由斯坦福大学科学家开发。LYTACs由一个低聚糖肽（oligoglycopeptide）基团、一个抗体以及一个linker组成。低聚糖肽基团可结合名为CI-M6PR的细胞表面受体（一种溶酶体靶向受体），抗体可结合一个特定的跨膜或胞外蛋白。在LYTAC与CI-M6PR和靶蛋白同时结合时，所产生的CI-M6PR-LYTAC-靶蛋白复合物会被细胞膜“吞没”，形成一个运输囊泡。囊泡会将复合物运输到溶酶体中(一种含有蛋白质降解酶的细胞器)，之后靶蛋白被降解，受体进入循环再利用。这一重要发现于去年7月发表在Nature杂志上。在这项研究中，科学家们也成功利用LYTACs降解了PD-L1。科学家们认为，LYTACs作为能够扩大可降解蛋白质范围的有效工具，前景非常令人期待。
也许，正如Nature杂志在一篇评论文章所述，随着已有蛋白降解技术不断成熟，新的蛋白降解技术不断出现，可能有一天，所有蛋白均可被靶向降解。到那时，疾病治疗领域可能会出现大量的里程碑进展。
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