​姜儒鸿点评 | 新型AAV载体，脑部疾病基因治疗新机会

近年来，基因疗法在遗传疾病治疗中的表现有目共睹，作为一种能从疾病的源头进行治疗的疗法，基因疗法的发展给了许多被遗传病困扰的患者治愈的希望。

基因疗法的载体多为血清型AAV（AAV1、AAV2、AAV3……），一般通过静脉注射进行全身给药。在一些神经系统疾病的治疗中，基因疗法则需要进行颅内或鞘内注射给药，这种给药方式对外科专业知识和技能的要求较高。虽然全身给药可以解决直接注射的局限性，但面临着两个困难，一是血脑屏障，二是血清型AAV载体对非中枢神经系统组织（多为肝脏）的高靶向性会带来肝毒性和其它安全性问题。

12月9日，发表在Nature Neuroscience上的一篇最新论文中，美国加州理工学院、NIH、中科院深圳先进技术研究院等机构的研究人员所开发的新型AAV载体不仅能避开肝脏，还能穿越血脑屏障（BBB）靶向脑细胞。

来源：Nature Neuroscience

AAV由两个主要部分组成，蛋白衣壳和包裹在衣壳内的遗传物质，其中，衣壳的形状和组成是影响AAV进入细胞的关键因素。使用AAV进行基因治疗需要将病毒的遗传物质从衣壳中去除，并将其替换为设计好的基因片段，其中包含特定基因的编码信息。

为了实现病毒衣壳的特异性，研究人员生成了一个工程改造的AAV衣壳序列文库，在AAV衣壳表面的多个位置引入多样性。通过两轮的筛选后研究人员选择了一组在静脉注射后能在小鼠中枢神经系统中高度富集并能避开不同外周器官的新型AAV变体。其中的AAV.CAP-B10变体递送后的转基因表达对中枢神经系统中的神经元具有高度特异性，在所有外周器官中显著降低，而且在小鼠肝脏中的靶向低到可以忽略不计。

衣壳工程化位置和CAP-B库表征（来源：Nature Neuroscience）

研究人员还观察到AAV.CAP-B10在小鼠脑部的转基因表达具有神经元特异性。

AAV.CAP-B10组织表达谱偏向于大脑，肝脏靶向显著降低（来源：Nature Neuroscience）

此外，狨猴（Callithrix jacchus）实验也表明了AAV.CAP-B10具有神经元特异性和低肝脏靶向性。AAV.CAP-B10在皮质、皮质下、小脑区域以及脊柱和背根神经节中递送后可以产生广泛而稳定的转基因表达。

论文通讯作者Viviana Gradinaru教授表示：“AAV工程赋予的新向性和组织特异性拓宽了AAV载体的研究方向，可以为脑部疾病提供新的治疗方法。有了这些新的衣壳，研究界现在可以在啮齿动物和狨猴中测试多种基因治疗策略，并建立必要的证据，以将这些策略应用于临床，为脑部疾病提供更安全、更有效的治疗选择。”

专家点评

ASC Therapeutics创始人兼CEO

姜儒鸿博士

 ‎‎‎‎姜儒鸿博士，复旦大学学士，北京农业大学（现为中国农业大学）硕士，俄克拉荷马州立大学博士。博士毕业后进入德州贝勒医学院继续深造，在著名的Douglas Burrin博士组中作博士后，期间共发表学术论文40 余篇。曾在多家生物技术和生物医药公司担任技术和管理要职，有着超过20年的研究工具开发、分子诊断产品和药物开发以及公司运营管理方面的经验。

• 研究亮点与不足

这篇文章是在Gradinaru教授课题组M-CREATE平台基础上的进一步筛选研究。与通常的AAV Capsid Shuffling进化方案相比，M-CREATE具有周期短，兼顾多样性与特异性等一系列优点。

本研究基于M-CREATE构建了针对位于AAV-PHP.eB病毒载体VP3 AA455 loop的7个氨基酸（AA452-AA460）、约含有12.8亿个不同AAV的筛选库，在Cre/Loxp小鼠体内进行阳性（脑部中枢神经系统）和阴性（肝脏）双向筛选。其中，AAV-PHP.eB的VP3 AA588 loop已经进行了靶向中枢神经细胞优化，但对肝脏细胞的转染率还需进一步降低以达到临床需求。经两轮筛选出的AAV.CAP-B10与AAV-PHP.eB相比，在小鼠和狨猴的中枢神经细胞中有较高的转染率和目的基因表达水平，并在肝脏细胞中转染率大大降低。

本文同步开展了针对神经细胞的正筛选和针对肝细胞的负筛选，最终获得多个高特异性神经细胞靶向AAV病毒株，能穿越血脑屏障靶向进入神经细胞的同时还极大降低了肝细胞的靶向性。这种同步筛选对于将来的临床应用有很大的借鉴意义。此外，本文将Cre小鼠模型中筛选获得的AAV变异病毒株应用于灵长类狨猴，进一步筛选出了脑组织尤其是神经细胞特异性高表达的AAV变异病毒株，这一发现将推动以工程AAV病毒载体为媒介的人类神经系统疾病的基因治疗。这种策略也可用于发现适用于灵长类其它特异性组织的工程AAV病毒变异株的筛选。

本研究的不足之处是AAV载体的靶向神经中枢细胞筛选是在小鼠体内进行的，筛选出的AAV.CAP-B10能否进行临床转化还需进一步证实。就目的基因mRNA表达水平来说，虽然在狨猴肝脏细胞中AAV.CAP-B10比AAV9目的基因mRNA水平降低了17倍，但还没有目的基因的蛋白质水平比较数据。另外，因为肝脏细胞是人体内主要的蛋白质合成场所，评价AAV.CAP-B10对肝脏细胞的低转染率需要目的基因在蛋白质水平的绝对数据，以降低人体对目的基因和AAV载体的免疫反应。最后，构建基于人源化小鼠模型或类器官的AAV筛选系统可能会更有效地应用于临床研究。

• 制约AAV基因疗法的几大因素

AAV基因疗法的安全性和疗效受多个因素的制约，包括AAV包装基因的选取和设计，衣壳蛋白对靶向细胞的结合特异性，AAV的生产和质量控制等等。另外，应用于基因治疗的AAV工程株与自然界野生型AAV并不相同，近年来关于工程株AAV在人基因组中的非靶向敲入也屡有报道，应引起重视。

在AAV生产方面，目前所面临的问题包括某些AAV血清型产量低，合规问题以及有经验的生产商有限。此外，即使在实验室阶段筛选出了优质的重组AAV载体，也常常因大批量生产的瓶颈导致临床实验的推迟，这与生产过程的复杂所造成的载体回收率和可重复性比较低有关，AAV大批量扩大化生产的限制会给基因疗法的产业化带来困难。另外，不同的血清型和靶向基因都会影响到AAV的生产工艺，这些都是在开发新产品之前需要综合考虑的因素。

• 拓宽基因疗法临床应用的关键

目前基因治疗中最困难和最有挑战性的一步当属药物的靶向递送，找到具有高特异性的AAV病毒株对于靶向递送的效果至关重要。另外，患者的免疫排异反应始终是制约AAV长期疗效的关键环节之一。

由于基因治疗仍是一个比较新的领域，如何测定基因治疗药物的有效性尤其是安全性，目前并未形成成熟的评估体系。发展和建立基因治疗药物有效性和安全性的评估平台和方法也是药物研发单位和管理部门正在合作解决的问题。

• 非病毒载体 VS 病毒载体

从长期看，非病毒载体基因疗法是大势所趋。相比于AAV基因疗法，非病毒载体的范围非常广泛，多采用化学合成材料，具有低毒性，低成本，低免疫反应，可装载DNA的尺寸比AAV更宽泛的特点，并且可以装载DNA以外的成分，例如RNA和蛋白。

但是，目前任何非病毒载体的递送效果和疗效持续性均远低于病毒载体。近期来看，病毒载体基因疗法仍将是临床首选。

• ASC Therapeutics的基因疗法布局

ASC Therapeutics（ASCT）拥有自主创新的基因编辑治疗、基因治疗及细胞治疗技术平台，产品管线包括异体细胞治疗与第二代和第三代基因疗法，公司在美国和中国均有战略部署。

今年7月初，ASCT自主研发的，拥有全球权利的基因治疗药物ASC-618通过FDA IND审批，本次成功申请，不仅使ASCT成为在基因治疗领域首家向FDA提交IND申请的华人创办的公司，还是对华人领导的突破性基因治疗（+基因编辑治疗）平台技术和CMC系统的第一个验证的里程碑事件。

ASC-618是第二代A型血友病基因治疗产品，其特点是：（1）优化了目的基因表达和提高了凝血8因子外分泌效率；（2）低AAV治疗剂量（只有第一代A型血友病基因治疗产品的2-10%的AAV治疗注射剂量）；（3）更经济的生产成本。ASC-618在明年上半年将开始美国临床I/II期试验。另外，ACST基因编辑治疗药物管线中的ASC-518（A型血友病基因编辑治疗产品）预计明年将申报FDA IND，2023年启动临床试验。

• 基因疗法前景展望

随着ZFN、TALEN，尤其是CRISPR等基因编辑技术的兴起，基因疗法显示出广阔的前景，未来3-5年，监管部门（FDA、NMPA等）将继续与生物医药公司、临床医生和病人收集更多的临床试验数据，进一步推动基因疗法走向成熟。同时，随着PPR等RNA编辑技术的逐步成熟，未来的基因调控将在更加精细化、可控化、多基因编辑协同调控等方面有所突破。

长远来看，如果把青霉素给细菌感染疾病带来的福音作为参照，50-100年后，基因疗法也将是遗传病和代谢性疾病治疗的常规疗法，甚至可能会带来这些疾病的治愈。

参考资料：

[1] Goertsen, D., Flytzanis, N.C., Goeden, N. et al. AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset. Nature Neuroscience (2021)

[2] New technology is one step closer totargeted gene therapy（来源：加州理工学院）

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