BioAI 前沿技术｜空间转录组学—癌症药物挖掘的新一代技术革命
针对高异质性、强耐药性、治疗后复发的癌症，高效的药物挖掘至关重要，空间转录组学可用于探究细胞间相互作用和细胞间信号传导，使科学家能够了解细胞环境中肿瘤反应和耐药性的分子基础。我们非常激动的看到，空间转录组学在最近多项工作中，帮助研究人员分析患者样本、识别新的生物标志物和药物靶标，并进一步接近真正的个性化医疗。本期VIP内容预览中，我们给各位会员带来单细胞测序先驱美国10X Genomics的最新的一个博客翻译，并添加了空间转录组数据分析工具BMS Sptial Portal和Domino的简介。欢迎对空间转录组感兴趣的学生、老师、从业人员加入我们俱乐部VIP项目，一起探索更多前沿BioAI的动态。 HealthX BioAI团队
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达尔文雀与高度异质性的肿瘤
查尔斯·达尔文的进化论受到栖息在加拉帕戈斯群岛的各种雀类的启发。达尔文雀是从数百万年前到达这些岛屿的物种进化而来的。它们最显着的特征是它们种类繁多的喙，每一种都非常适合它们的食物偏好，这是几个世纪以来自然选择的结果。
复杂人类肿瘤中的异质细胞就像加拉帕戈斯群岛臭名昭著的达尔文雀—即使是最激进的治疗，适应性最强的也能存活下来。肿瘤内自然选择的影响似乎可以在一夜之间发生，并使治疗从有希望变为无效。
图 1. 自然选择使高度异质性肿瘤的治疗复杂化。肿瘤内的固有耐药细胞通常在治疗后存活下来，并迅速形成高度耐药的肿瘤。针对异质性肿瘤的有效治疗必须在常规治疗之前通过靶向耐药细胞来消除它们。治疗策略包括通过表型转换或特异性消除耐药细胞来推动细胞做出反应(Tammela T and Sage J. Annu Rev Cancer Biol 4: 99–119 (2020).).
高度异质性的肿瘤受益于自然选择，对患者极其不利。这些肿瘤适应性强，通常对靶向治疗有抵抗力。需要新的疗法或联合疗法来有效治疗这些不断发展的肿瘤。
但是在实验室中重现培养高度异质性的肿瘤是很棘手的。肿瘤异质性不仅仅涉及细胞间的变异性。肿瘤周围的环境，包括浸润的免疫细胞和脉管系统，也会影响肿瘤的生长、恶性程度和耐药性。特定癌症的小鼠模型（包括源自患者的异种移植物（xenografts））通常无法完全概括肿瘤内部和周围的异质性 (1, 2)。
直奔源头是描述肿瘤异质性影响的最佳方式，而单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 的出现正是做到了这一点。scRNA-seq 改变了研究人员研究患者样本中肿瘤异质性的影响方式，并对肿瘤及其微环境中极其复杂的细胞和遗传多样性提供了重要见解 (3)。但是使用新鲜或固定细胞或细胞核的 scRNA-seq 需要组织解离，这会破坏细胞间相互作用和肿瘤微环境 (TME)。
空间转录组学使研究人员能够在其原生结构中可视化生物标志物、空间相互作用和肿瘤转录组，从而使研究人员能够更好地识别潜在的药物靶点和耐药机制。研究人员使用我们的（10X Genomics） Visium 空间基因表达技术开发了可重现的肿瘤药物发现工作流程，并确定了治疗后患者肿瘤样本中的耐药和复发机制。
探索癌症群岛
Bristol Myers Squibb 的研究人员最近发布了试点数据，证明空间转录组学不仅可以使用新鲜或冷冻组织，还可以使用 FFPE 样本--最常见的库存来源、患者-衍生肿瘤样本 (4)。
他们使用 Visium Spatial Gene Expression 分析了 40 个新鲜和冷冻组织样本——包括来自具有复杂 TME肿瘤微环境的小鼠肿瘤模型和具有不同异质性水平的患者肿瘤的组织。最终，他们不仅准确地捕获了高度复杂肿瘤的结构和空间位置，而且还确定了推定的肿瘤生物标志物。
https://www.cell.com/cell-reports-methods/pdf/S2667-2375(22)00237-5.pdf
制药研究小组开发了一个集成基因表达和数字病理数据的正交验证框架，称为空间验证框架。他们使用该框架来验证表达数据分布，并使用数字病理学注释解释数据，以指导生物标志物发现和目标验证。
他们使用神经网络生成了一个深度学习模型来注释 H&E 染色组织样本的形态，以与空间转录组数据相结合，这些注释经过了病理学家的验证。为了结合空间转录组学分析。即使用 SpaceRanger、Seurat v4 和其他 R 库进行处理，他们将每个spot分配给与之重叠最多的一个数字病理学意义上的组织隔室。这种共定位分析帮助该小组验证了不同组织区域内已知的生物标志物和细胞类型，并识别了新的、临床相关的生物标志物和受体-配体对。
研究人员首先使用他们的工作流程，使用 Visium Spatial Gene Expression 和数字病理学分析从健康老鼠身上分离的新鲜冷冻结肠组织样本。他们都微调了成像方法的细节，并验证了空间转录组学分析的基因表达谱与小鼠结肠中一致发现的稀有细胞类型的组织学组织良好的区室和特征良好的标记基因相匹配。该分析捕获了标志性隔室（如上皮细胞）和稀有细胞（如肠神经元）的基因表达谱。
他们的分析也准确地代表了肿瘤组织结构。该小组通过监督机器学习的数字病理学分析了 H&E 染色的组织切片，并确定了八个不同的图像纹理或隔间，包括隐窝。通过空间转录组学分析鉴定的从头基因表达簇与先前报道的预期在鉴定的区室中的细胞类型的生物标志物对齐。
研究最终目标是证明空间转录组学可以有效地表征复杂、异质的癌组织并获得新的见解。研究人员使用来自大鼠和患者的肿瘤样本来证明空间转录组学分析在高度异质性致瘤组织中始终如一地识别出推定的生物标志物和成对相互作用。
例如，他们分析了来自患者来源的胰腺导管腺癌 (PDAC) 肿瘤的 FFPE 块的组织切片，并确定了几种已知的肿瘤固有生物标志物，包括 MIF（一种调节炎症以帮助肿瘤免疫逃避的配体）和 PDAC 相关的成对相互作用, 如肿瘤发生促进对CXCR4及其配体CXCL12的过度表达。总的来说，作者为其他小组绘制了一张地图，以探索癌症样本并获得对癌症和潜在疗法的新见解。
该小组还开发了一个名为 BMS Spatial Portal 的可视化应用程序，支持探索空间基因组学数据。通过门户网站，其他人可以探索本研究中收集的基因表达和生物标志物数据，并分析他们使用出版物中描述的方法产生的数据。
BMS Spatial Portal
http://periscopeapps.org:3838/spatial_portal/
研究自然选择的影响
约翰霍普金斯大学医学院的另一组研究人员采用肿瘤切除的 Visium 空间基因表达分析来确定对新辅助卡博替尼（cabozantinib，一种阻断 VEGF的抗血管生成药物）和在1b期临床试验中PD-1 抑制剂纳武单抗 (CABO/NIVO) 的疗法有无反应的肝细胞癌 (HCC) 患者肿瘤的临床相关差异 (5)。
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.01.10.523481v1
HCC 是最常见的原发性肝癌，是 2020 年第三大致命癌症 (6)。抗血管生成和免疫检查点抑制剂（主要是 PD-1 抑制剂）的联合治疗是目前对抗 HCC 的标准防线，但它对许多患者不起作用，即使是那些有时表现出良好初始反应的患者以后复发。不幸的是，目前没有已知的生物标志物可以区分反应者和非反应者。
约翰霍普金斯大学医学院的研究人员着手改变这种状况。他们最近针对在手术切除前接受 CABO/NIVO 治疗 8 周的患者进行了一项 1b 期临床试验(7)。参与研究的 15 名患者中有 5 名出现了主要的病理学反应（在 90% 或更多的肿瘤中可见坏死）。这五名应答者的肿瘤切除显示免疫浸润增加，免疫抑制性巨噬细胞数量减少。
该小组想要了解使这些肿瘤更容易受到 CABO/NIVO 影响的选择压力（selective pressure），并找到可以预测患者反应的生物标志物。他们确定深入挖掘数据的最佳方式是使用 Visium 空间基因表达技术进行高分辨率空间分析。
“提供空间分辨基因表达数据的技术的最新发展引入了强大的方法来分析 TME 并了解肿瘤内在特征如何与其他关键细胞类型的分布相关，以促进肿瘤发展和对治疗的反应，”作者说 (5 ).
他们通过无监督聚类分析了七个冷冻手术 HCC 样本（四个响应者和三个无响应者）的空间转录组学数据，并确定了 HCC 肿瘤中常见的细胞群，包括癌细胞、癌症相关的成纤维细胞和免疫细胞。病理学家通过组织学分析证实了这些结果。
他们不仅发现免疫细胞和成纤维细胞在应答者 HCC 样本中更为普遍，而且发现在应答者中差异表达最多的基因是免疫相关基因，包括细胞因子CCL19、CXCL14和CXCL6。无反应者样本主要由癌细胞和高表达的已知肿瘤标志物组成，例如AFP和IGF2。当他们进行基因集富集分析时，他们发现无反应者样本不仅缺乏免疫相关基因的表达，它们还表达了高水平的参与代谢和细胞增殖途径的基因。
这些结果表明，无反应的肿瘤细胞对 CABO/NIV 治疗的免疫激活作用反应较弱，并继续不受控制地扩张和扩散。
约翰霍普金斯医学院的研究人员随后通过分析邻近细胞中的表达确定了相关的细胞间相互作用。癌细胞和肿瘤微环境之间的串扰在肿瘤反应和耐药性中起着关键作用。他们预计该分析将揭示潜在的生物标志物和治疗漏洞。
结果确实如此。他们分别分析了每个患者样本中癌细胞、免疫细胞和/或癌症相关成纤维细胞之间的相互作用，以解释异质性。他们确定了空间簇并应用计算工具 Domino 来寻找具有转录活性的细胞间信号通路 (8)。
Domino工具 https://www.nature.com/articles/s41551-021-00770-5
他们在应答者样本中与肿瘤细胞区域相邻的免疫细胞区域发现了受转录因子 PAX5（B 细胞分化和功能的关键调节因子）上调的基因的高表达。此外，PAX5 活性与高表达 B 细胞标记物的 Visium spots共定位。
癌细胞和癌症相关成纤维细胞相互作用的区域显示细胞外基质重塑调节通路的活性增加，其特征是胶原蛋白生成基因COL1A1和COL3A1的表达增加。
“这些发现表明，启动或维持 B 细胞活性的药物与 CAF 抑制剂联合使用可能是提高免疫疗法治疗 HCC 疗效的替代方法，”作者说。
这项研究阐明了反应者和非反应者之间的差异，但仍然存在一个紧迫的问题：为什么对 CABO/NIVO 治疗有反应的五名患者中有一名在外科手术治疗后一年后疾病复发？他们将这名混杂患者的样本与肿瘤在手术后三年仍未复发的四名患者进行了比较。
复发性病人和其他病理缓解者之间的关键区别在于是否存在癌症干细胞 (CSC) 分子特征。CSC 无限增殖并且对癌症治疗具有高度抵抗力，包括像 PD-1 抑制剂纳武单抗这样的免疫疗法。具有 CSC 的肿瘤通常在治疗后复发。他们仔细研究了癌症基因组图谱中具有 CSC 分子特征的其他 HCC 样本，发现这些肿瘤高度浸润了免疫抑制性 T 细胞，而不是免疫激活 B 细胞。他们的发现建立在发现 CSC 很容易逃避免疫系统并在治疗后持续存在。
最后，数据使研究人员不仅能够区分反应者和非反应者，而且还能找到耐药和复发的标志物。无反应者不包含 CSC 分子特征。这种划分应该有助于研究人员继续微调和个性化治疗。
超越进化
空间转录组学使科学家能够了解细胞环境中肿瘤反应和耐药性的分子基础。正如上述研究所证明的，它对于研究细胞间相互作用和细胞间信号传导的作用特别有用，这在肿瘤与其微环境的相互作用中起着关键作用。我们很高兴看到空间转录组学如何继续帮助研究人员分析患者样本、识别新的生物标志物和药物靶标，并进一步接近真正的个性化医疗。
References:
Tammela T and Sage J. Investigating tumor heterogeneity in mouse models. Ann Rev of Cancer Biol 4: 99–119 (2020). doi: 10.1146/annurev-cancerbio-030419-033413
Yuan Z, et al. Presence of complete murine viral genome sequences in patient-derived xenografts. Nat Commun 12: 2031 (2021). doi: 10.1038/s41467-021-22200-5
Gonzalez-Silva L, et al. Tumor functional heterogeneity unraveled by scRNA-seq technologies. Trends in Cancer 6: 13–19 (2020). doi: 10.1016/j.trecan.2021.02.001
Lyubetskaya A, et al. Assessment of spatial transcriptomics for oncology discovery. Cell Reports Methods 2: 100340 (2022). doi: 10.1016/j.crmeth.2022.100340
Zhang S, et al. Spatial transcriptomics analysis of neoadjuvant cabozantinib and nivolumab in advanced hepatocellular carcinoma identifies independent mechanisms of resistance and recurrence. bioRxiv (2023). doi: 10.1101/2023.01.10.523481
Sung H, et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin 71: 209–249 (2021). doi: 10.3322/caac.21660
Ho WJ, et al. Neoadjuvant cabozantinib and nivolumab convert locally advanced hepatocellular carcinoma into resectable disease with enhanced antitumor immunity. Nat Cancer 2: 891–903 (2021). doi: 10.1038/s43018-021-00234-4
Cherry C, et al. Computational reconstruction of the signalling networks surrounding implanted biomaterials from single-cell transcriptomics. Nat Biomed Eng 5: 1228–1238 (2021). doi:10.1038/s41551-021-00770-5
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