PNAS | 马里兰大学Junfang Wu教授阐明自噬调控改善神经系统创伤后的急性轴突损伤的相关分子机制

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2022年11月14日，美国马里兰大学教授Junfang Wu、副教授Marta M. Lipinski合作《PNAS》杂志（2022 IF：12.779）发表题为"Autophagy protein ULK1 interacts with and regulates SARM1 during axonal injury"的研究论文，该研究揭示了自噬激活蛋白ULK1可以在脊髓损伤后，与轴突退行性病变核心信号蛋白SARM1结合，导致轴突变性，促进神经突破碎崩解。

自噬作为一种广泛存在的细胞活动，在不同物种、不同细胞间均广泛表达，参与了包括神经退行性病变、肿瘤、自身免疫病和心血管疾病在内的多种疾病的发生发展。在神经系统中，尽管自噬通常具有保护作用。但有研究报道，自噬在神经系统急性损伤后，加速了神经元的损伤变性。已有的一系列研究提示自噬可能在轴突损伤过程中提供能量并为吞噬细胞提供吞噬信号；在视神经损伤与脊髓损伤模型中，抑制自噬可减轻损伤。因此，本文研究者聚焦于自噬激活蛋白Ulk1与轴突退变信号蛋白SARM1，探究自噬通路与轴突降解通路之间的联系，寻找自噬加速轴突变性的分子机制。

该研究首先以GFP-LC3转基因小鼠为实验材料，通过在脊髓T10节段施加冲击，构建脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）模型。通过免疫荧光染色，发现SCI后在脊髓白质出现大量LC3-bulb结构。接着通过小胶质细胞标记CX3CR1、神经突损伤标记SMI32标记结合电子显微镜，证实了这种LC3-bulb结构是SCI损伤后肿胀的轴突（图 1-E，G，H）。

图 1 SCI后出现大量axonal LC3+-bulb（图源：Choi HMC, et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2022）

接着，研究者检测了SCI发生后自噬相关信号分子p62、Ulk1、Atg13 p-S318以及轴突变性通路中的关键信号蛋白SARM1、MAP3K12、MYCBP2的时空动态表达情况。结果表明，在肿胀轴突的LC3-bulb内，自噬信号分子与SARM1蛋白表现出了高度的时空一致性。ULK1、Atg13 p-S318在损伤后6-24h内高表达（图 2-C~H），这与SARM1蛋白的表达时空高度一致（图 3-A~D）。相反，在同样受到损伤却未见明显肿胀的轴突内，二者的表达时间峰不同（图 2-I、J，图 3-E、F）。这表明：自噬信号分子与轴突损伤通路信号分子的时空共表达可能是介导轴突肿胀变性的关键。

图 2  SCI后自噬信号分子的时空表达规律（图源：Choi HMC, et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2022）

图 3  SCI后轴突损伤信号分子的时空表达规律（图源：Choi HMC, et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2022）

        在此基础上，研究者通过自噬抑制剂、siRNA技术，以小鼠原代皮层神经元的谷氨酸诱导下轴突损伤为模型，探究抑制自噬对轴突变性、SARM1表达水平的影响。他们发现，不论是抑制自噬起始PI3K活性的3-MA、抑制ULK1激酶活性的SBI、抑制溶酶体酸化的CHQ，还是抑制Ulk1表达的siRNA，均可以减轻轴突损伤（图4-A~C），降低SARM1在神经突的表达水平（图 4-D~G）。值得注意的是，siRNA+CHQ相比单独的siRNA组并没有表现出更好的疗效，提示siRNA的Ulk1拮抗作用是通过一种自噬依赖的方式改善轴突变性的。

图 4  抑制自噬改善神经元变性，降低SARM1表达（图源：Choi HMC, et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2022）

最后，为探究自噬调控SARM1的具体机制，研究者运用人胎肾细胞HEK293T，通过coIP技术测定生理水平下Ulk1与SARM1的蛋白互作。并通过转染SARM1突变缺陷蛋白，探究SARM1蛋白与Ulk1结合的功能结构域。证实：Ulk1蛋白可以与SARM1蛋白结合（图 5-A~E），并且这一结合作用依赖于SARM1蛋白的SAM结构域（图 5-F）。Ulk1蛋白与SARM1蛋白的结合作用在小鼠原代皮层神经元细胞、小鼠SCI脊髓组织中同样得到了验证（图 5-G~J）。让人意外的事，虽然自噬抑制剂可以减少小鼠大脑神经元在谷氨酸毒性作用下的SARM1蛋白积累水平，但是对Ulk1-SARM1蛋白结合无明显抑制（图 5-H）。提示Ulk1-SARM1结合是以一种非依赖Ulk1激酶活性的方式实现的。

图 5 生理情况下SARM1蛋白可以通过SAM结构域与Ulk-1蛋白结合（图源：Choi HMC, et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2022）

        综上，该研究揭示了自噬信号分子Ulk1和轴突损伤信号分子SARM1之间的重要联系。所提供的研究证据表明，自噬信号分子Ulk1可结合SARM1分子，促进轴突损伤；这两种关键信号分子的结合需要SARM1蛋白的SAM结构域，并以一种不依赖Ulk1激酶活性的方式实现。此研究进一步阐明了自噬在神经系统损伤中的多面作用，揭示Ulk1可以作为潜在靶点，通过其调控改变SARM1信号通路，改善神经系统创伤后的急性轴突损伤。

该研究由美国马里兰大学教授Junfang Wu、副教授Marta M. Lipinski联合指导完成，美国马里兰大学Harry M. C. Choi为本文的第一作者。

原文链接：https://www.pnas.org/doi/suppl/10.1073/pnas.2203824119

稿件来源并致谢：丁芃芃 

参考文献：Choi HMC, Li Y, Suraj D, Hsia RC, Sarkar C, Wu J, Lipinski MM. Autophagy protein ULK1 interacts with and regulates SARM1 during axonal injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022 Nov 22;119(47):e2203824119. doi: 10.1073/pnas.2203824119. Epub 2022 Nov 14. PMID: 36375051; PMCID: PMC9704737.

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