干细胞治疗前必读丨间充质干细胞制剂的安全性分析和质控要点
间充质干细胞（MSC）药物，已经不是传说了！
2018年欧盟批准MSC为干细胞药物治疗克隆恩并发肠瘘。
早些年韩国、日本、加拿大、新西兰等批准MSC为干细胞药物治疗移植物抗宿主病（GVHD）。英国和欧盟的治疗指南推荐MSC作为治疗2-4级急性GVHD的三线治疗药物。
虽然间充质干细胞药物已经被一些国家批准上市，但是依然不少人对间充质干细胞的安全性充满疑虑，原因不详。本文就间充质干细胞的安全性再做一次阐述。
不少动物实验证明了输入MSC的安全性，但临床研究观察和评价更具有意义。健康志愿者输入MSC后，不出现输入性毒性反应（心率、呼吸、血氧饱和度、血压），各器官功能未见异常[1]。大部分研究发现患者输入MSC后，没出现或者轻微的输入性毒性反应[2-21]。
MSC输入治疗后，发烧是最常见的不良反应，文献中的最高发生率大概为39%[11, 19, 22, 23]。对目前大量的临床试验的文献进行分析（Meta-Analysis），发现MSC输入治疗仅仅与发烧存在一定的关联性，而与其他文献所报道的不良反应没有必要的联系，认为MSC治疗是安全的[24]。
一般无需特别处理，病人会自然恢复。有研究推测发烧的原因可能与输入异体MSC引起的急性炎症反应有关[25]。仅有三个临床试验报道MSC引起心脏毒性，表现为一过性心律不齐，发生率为7%（30例患者中有2例出现）[10, 26, 27]。只有一个随机对照试验发现MSC治疗16名患者，有3名患者神经系统症状；而对照组36名患者中，有5名患者出现相同症状[3]。
随机对照临床试验，通过统计学分析，发现MSC治疗组和对照组的感染率没有差异，明确提出MSC治疗不会增加感染的风险[2, 3, 5]，而且MSC治疗组和对照组在恶液质和成瘤方面没有差异[2-5]。长期观察也没有发现病人增加微生物感染和MSC致瘤的现象[18, 28]。更有日本学者给41例软骨损伤的病人输入MSC治疗，观察了11年，均未发现肿瘤的发生[29]。
随机对照试验（RCT）是目前证明药物临床有效性的金标准式方法。MSC随机对照试验（RCT）的所发表的文章如下图：
MSC治疗的不良反应与MSC悬液中的一些杂质有密切的联系，比如内毒素含量、胎牛血清的残留量等。有研究发现利用胎牛血清（FBS）培养MSC，可能会增加MSC的免疫原性[30, 31]。考虑到胎牛血清中存在大量的异种蛋白，应该尽可能地降低MSC细胞悬液中的胎牛血清残留量（国家规定不能超过50ng/ml）。
胎牛血清（FBS）是研究实验室中最常见的培养补充液。有专家认为胎牛血清有几个劣势：成本高、批次变异(产生于其1800种蛋白质和4000种代谢物的不同浓度)、可用性有限(只有三分之一的胎牛血清产品符合细胞治疗的监管要求)、各种猪的病毒污染和以及引起异种免疫反应的可能性等等问题。
欧盟2013年有文件《Guideline on the use of bovine serum in themanufacture of human biological medicinal products》规定胎牛血清供应方需要提供安全性检测，关键是不能污染了各种病毒（bluetongue and related orbiviruses、bovine adenovirus、bovine parvovirus、bovine respiratorysyncytial virus、bovine viral diarrhoea virus、rabies virus、reovirus 3、bovineviraldiarrhoea virus、bovine polyoma virus等）。
澳大利亚治疗品管理局允许使用FBS生产临床级材料，只要它来自澳大利亚或新西兰等没有疯牛病疫情的国家的牛。
和欧盟的态度一样，美国FDA并不反对胎牛血清的应用。比如对病毒疫苗的生产就需要用到胎牛血清，FDA官网是这样描述的：“Viral vaccines are produced in livingcells, which, similarly, require the addition of complex growth mediacomponents, such as fetal calf serum.” fetal calf serum指的就是胎牛血清。但FDA对胎牛血清的描述就没有欧盟那么具体，只需要保证胎牛血清不能来自疫区，明确提及不能污染口蹄疫病毒和疯牛病病毒。
如果用非动物源血清来培养MSC，则可以避免这方面的问题，但是也带来其它问题，比如人血清所带来的各种潜在病毒污染等。无血清成份的培养基，是一个理想状态；但是缺少血清的培养基培养MSC，MSC的细胞质量明显不如血清培养的MSC。
总体来看，间充质干细胞治疗具有良好的安全性记录，对病人无明显毒副作用，少数病人出现注射局部不适、短暂低热等，对症处理即可。
虽然MSC的安全性比较好，但是也需要密切注意MSC产业化过程中的质量控制（质控）。下面是质控要点，参考《干细胞制剂质量控制和临床前研究指导原则》（注：这个文件非常重要！）。
（1）对干细胞供者的要求
需要排除MSC供者的家族遗传性疾病，而且检验筛选证明无人源特定病毒（包括HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等）的感染，无梅毒螺旋体感染。必要时需要收集供者的ABO血型、HLA-I类和II类分型资料，以备追溯性查询。
（2）所有的干细胞相关操作（包括采集、分离、培养和制备）在符合GMP要求基础上严格执行。
对来源丰富的同一批特定代次的细胞建立多级的细胞库，如主细胞库（Master Cell Bank)和工作细胞库（Working Cell Bank）。细胞库中细胞基本的质量要求，是需有明确的细胞鉴别特征，无外源微生物污染。至少需要在工作细胞库阶段应进行全面的内外源致病微生物（包括HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等）、详细的干细胞特性检测，基因组稳定性，以及细胞纯度分析，干细胞特性包括特定细胞表面标志物群、表达产物和分化潜能等。
（3）培养基
MSC培养所用的培养基成分应有足够的纯度并符合无菌、无致病微生物及内毒素的质量标准，残留的培养基对受者应无不良影响；在满足干细胞正常生长的情况下，不影响干细胞的生物学活性，即干细胞的“干性”及分化能力。在干细胞制剂制备过程中，应尽量避免使用抗生素。
若使用商业来源培养基，应选择有资质的生产商并由其提供培养基的组成成分资料及相关质量合格证明。必要时，应由专业检定机构对每批培养基进行质量检验，并出具检验报告。MSC细胞制剂应确保其无特定动物源性病毒污染。严禁使用海绵体状脑病流行区来源的牛血清。
如必须使用动物血清，须进行牛源特定病毒的检测。如使用胰酶等猪源材料，应至少检测猪源细小病毒。若培养基中含有人的血液成份，如白蛋白、转铁蛋白和各种细胞因子等，应明确其来源、批号、质量检定合格报告，并尽量采用国家已批准的可临床应用的产品。
（4）致瘤性
MSC整个生产制备工艺，需要进行致瘤性验证，从而确保MSC制剂的临床使用安全性。不管是异体来源的干细胞制剂，还是经体外复杂操作的自体干细胞制剂，须通过免疫缺陷动物体内致瘤试验，检验细胞的致瘤性。
（5）生物学效力试验
可通过检测干细胞分化潜能、诱导分化细胞的结构和生理功能、对免疫细胞的调节能力、分泌特定细胞因子、表达特定基因和/或蛋白等功能，判断干细胞制剂与治疗相关的生物学有效性。对间充质干细胞，无论何种来源，应进行体外多种类型细胞（如成脂肪细胞、成软骨细胞、成骨细胞等）分化能力的检测，以判断其细胞分化的多能性（multipotency）。
作为特定生物学效应试验，项目申请者应提供与其治疗适应症相关的生物学效应检验内容及结果。随着研究的进展，建议项目申请者针对临床治疗的适应症，不断研究更新生物学效应检测方法。如研究介导临床治疗效应的关键基因或蛋白的表达，并以此为基础提出与预期的生物学效应相关的替代性生物标志物（surrogate biomarker）。
（6）MSC制剂稳定性研究及有效期的确定
应进行干细胞制剂在储存（液氮冻存和细胞植入前的临时存放）和运输过程中的稳定性研究。检测项目应包括细胞活性、密度、纯度、无菌性等。根据干细胞制剂稳定性试验结果，确定其制剂的保存液成份与配方、保存及运输条件、有效期，同时确定与有效期相适应的运输容器和工具，以及合格的细胞冻存设施和条件。
温馨提示：目前情况下，生物公司的干细胞制剂，一定要依托中检院做检验。
本文作者 | 东海先生
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