综述｜间充质干细胞有望成为“男性不育”的终结者
干细胞技术 有望解决男性不育的问题
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Overview 综述
导语：男性不育的病因复杂，目前尚未有理想的治疗手段。MSC 的多向分化潜能及旁分泌特性为男性不育患者的康复带来了新的希望。MSC 根据其来源不同，可分为骨髓MSC、脂肪MSC和脐带MSC等。这些类型的MSC已经开展了大量的体内外研究，并取得了令人满意的结果。众多研究表明 MSC 在特殊条件诱导下或移植入睾丸后，能够分化为生殖细胞。同时，MSC 体内移植后能分泌营养因子，改善局部生精微环境并重塑精子发生过程。
单位：上海泉生生物科技有限公司
作者：钱孝鑫 刘艳
男性不育症，即夫妻双方在未采用避孕措施的情况下正常性生活1年以上，由于男方因素而导致女方不孕。由于遗传、环境污染等多方面因素的影响，不育症的发病率正逐渐上升，已高达10%～15% ，成为继肿瘤和心血管疾病之后危害人类健康和社会稳定的第3大要素［1-3］。男性不育症包括少精子症、弱精子症、无精子症、畸形精子症、白细胞精子症和死精子症等多种类型。目前，临床上常用的治疗方法包括: 药物、手术和辅助生殖技术(assisted reproductive technology，AＲT) 。
药物治疗主要针对睾丸因素所致的生精功能低下，从而促进精子发生。手术治疗主要针对导致男性不育的病因进行治疗，包括精索静脉曲张、睾丸下降不全和输精管梗阻等。AＲT 技术的应用虽然让不少不育症患者受益，但其成功率低［4］、睾丸或附睾取精术后常并发睾丸萎缩、附睾结节，治疗效果不能完全满足临床的需求。此外，对于基因缺陷导致的不育，可能基因治疗更为有效［5］，但存在脱靶导致的安全性及伦理等问题，离实际应用仍有很长的距离。
目前虽然已经发现了很多引起男性不育的原因，治疗手段的进步使大部分男性不育能通过AＲT技术得到纠正，但有部分患者内源性生殖细胞缺失，不能通过辅助生殖技术或药物进行治疗［6］。间充质干细胞( mesenchymal stem cell，MSC) 因其获取方便、增殖能力强和免疫原性低等优点，已成为再生医学领域研究的热点。随着研究的不断深入，相信MSC将为男性不育的治疗提供新的思路和方法。
MSC特性及治疗机制
MSC作为具有自我更新和多向分化能力的多功能细胞，存在于人体或动物个体发育的各个阶段的组织器官中，是各种分化细胞或特化细胞的初始来源。MSC具有免疫调节功能和低免疫原性，异种移植能克服免疫排斥反应，长期存活［7-8］。MSC能够分泌可溶性因子和微囊泡，调节免疫细胞的功能［9-10］。组织损伤时产生的趋化因子可诱导MSC的归巢效应［11］。另外，MSC还可分泌生物活性因子，抑制细胞凋亡，减轻炎症及纤维化，促进血管再生［12］。MSC主要存在于结缔组织和器官间质中，具有间质细胞又有内皮及上皮细胞特征的非终末分化细胞。MSC来源广泛，包括骨髓、脐带、脂肪、胎盘、骨骼肌、骨膜、真皮等。
目前临床应用相对较广的MSC有骨髓MSC、脐带MSC、脂肪MSC等。MSC移植作为男性不育理想的治疗手段，其在睾丸微环境中的长期存活及对生精功能的修复已得到证实，其主要作用机制包括:
① MSC能通过旁分泌作用分泌营养因子(相关因子作用见表1) ，促进其他干细胞的增殖和分化［13］;
② MSC 移植后能归巢至损伤部位［14］，在微环境诱导下向间质细胞和支持细胞分化，促进组织修复［15，21］。
表1 干细胞分化相关细胞因子及功能[16]
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MSC在男性不育中的应用
| 01骨髓间充质干细胞( bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC) 治疗男性不育
BMMSC是骨髓中除造血细胞以外的中胚层来源的细胞，具有自我更新及多向分化能力。其细胞特性稳定，可以分化成为肝脏、软骨、肌肉、神经元等组织细胞。2006年，Nayernia等［17］用转基因小鼠提取BMMSC，经体外培养后用视黄醇进行诱导，部分BMMSC表达Oct4、Stella、Mvh、Dazl、Piwil2、Stra8、c-kit等原始生殖细胞和精原干细胞标志物，首次证实骨髓来源的MSC 能分化为雄性生殖细胞。研究人员将这些雄性生殖细胞移植到不育小鼠睾丸内，发现移植的细胞能在睾丸内存活和增殖，部分迁移至生精小管基底膜。但移植的细胞不表达减数分裂后生殖细胞标志物，表明BMMSC 移植入体内后不能进一步分化为精母细胞和精子细胞。随后，Lue等［18］的研究同样证实了这一点。Lue 等将绿色荧光蛋白(GFP) 标记的小鼠BMMSC注射入不育小鼠生精小管内，发现BMMSC能分化为精原细胞、间质细胞和支持细胞，但这些移植的BMMSC不能进行减数分裂产生精子。后来 Lassalle 等［19］报道BMMSC移植入小鼠体内不能重建精子发生过程。在小鼠体内维甲酸的诱导下，移植的BMMSC能表达生殖细胞标志物，但不能转分化产生生殖细胞，亦不通过减数分裂产生单倍体细胞。
另有学者将BMMSC与Sertoli 细胞进行体外共培养，发现 BMMSC 表达生殖细胞特异性标志物，然后将体外诱导的BMMSC移植入白消安处理的不育大鼠体内，部分BMMSC迁移至生精小管基底膜处，并表达精原干细胞和精原细胞标志物，如 Vasa、Stella、SMAD1、Dazl、GCNF、HSP90α、integrinβ1和c-kit等［20］。另外，Ｒahmanifar等［21］将异体BMMSC移植进白消安处理的大鼠一侧睾丸，发现移植侧的睾丸生精功能明显优于未移植侧。研究发现，一部分男性不育的原因是由于自身存在针对精子的抗体，从而引发自身免疫反应，Aghamir等［22］将 BMMSC移植进创伤性睾丸破裂的Balb /c小鼠体内，发现BMMSC可抑制抗精子抗体的产生，具有免疫调节的作用，有望治疗自身免疫引起的男性不育。
基于以上研究，Cai等［23］进一步将BMMSC分泌的细胞因子进行超滤浓缩，注射进白消安处理的小鼠体内，结果显示BMMSC的外泌因子能通过降低生精细胞凋亡、促进细胞间黏附因子表达，修复受损的生精功能。越来越多的研究表明，BMMSC移植入体内后虽然不能进行减数分裂，但能分泌营养因子、转化为生殖细胞，改善局部的生精微环境，促进睾丸生精功能的恢复。
| 02 脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cell，ADMSC) 治疗男性不育
ADMSC是一种来源于脂肪组织的干细胞，与BMMSC特性相似，具有自我更新和多向分化潜能，可向神经细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞及内皮细胞等多种特定细胞类型分化。此外，还具有取材容易、来源广泛、机体损伤小及增殖能力强等优点。自2001年Zuk等［24］首次从脂肪组织中分离得到 ADMSC 后，迅速成为组织工程和再生医学的研究热点。目前为止，与BMMSC相比，ADMSC应用于男性不育领域的研究报道较少。Cakici等［25］将GFP标记的ADMSC移植到白消安处理的大鼠睾丸网，移植侧睾丸形态正常，而未移植侧睾丸萎缩，生精小管内基本为空腔。睾丸内可检测到GFP + /VASA +和GFP + /SCP1 +双阳性表达的细胞，提示移植的MSC在睾丸微环境中能向生殖细胞分化。经过ADMSC治疗的大鼠，生精功能恢复，获得连续子代。随后，Mehrabani等［26］的研究验证了ADMSC的治疗作用。将ADMSC显微注射进不育大鼠的输出小管，经过ADMSC移植的睾丸内生精小管形态学正常，而未移植的睾丸生精小管内呈空腔化。另外，ADMSC移植后的多数生精小管内能观察到精子形成，说明ADMSC能改善生精微环境、修复不育大鼠的生精功能。
| 03 脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cell，UCMSC) 治疗男性不育
在脐带动静脉血管周围的粘蛋白样结缔组织被称为华尔通胶( Wharton＇s Jelly) ，从华尔通胶分离得到的基质细胞即为UCMSC，Sakamoto等［27］于1996年首次从人脐带华尔通 胶中分离出UCMSC。在实际应用中，骨髓间充质干细胞BMMSC存在数量少、易老化等问题，广泛应用受到一定的限制。而UCMSC细胞含量和增殖能力均优于BMMSC，且 UCMSC 分离自新生儿脐带，伦理争议低，同时，免疫原性也更低。基于UCMSC显示出的优越性，越来越多的研究人员将其用于男性不育的治疗。2010年Huang等［28］通过含有全反式维甲酸、睾酮及睾丸细胞条件培养液对人UCMSC 进行体外诱导，观察到人UCMSC分化成生殖细胞，并表达生殖细胞特异性标志物Oct4、c-kit、CD49f、Stella和 Vasa 等。后有学者进行了类似的研究，Xie等［29］将人UCMSC与Sertoli细胞进行体外共培养，模拟体内微环境，结果显示人UCMSC能分化为生殖细胞，并表达早期生殖细胞标志物Stella、Vasa及生殖细胞特异性标志物Dazl。Amidi等［30］利用不同的体外环境，对UCMSC进行诱导，发现睾丸条件培养液和维甲酸的组合能使 c-kit、DDX4、Piwil2、Dazl等生殖细胞特异性基因表达显著上调。在上述研究的基础上，有研究者将UCMSC显微注射到白消安消除内源性精子的小鼠生精小管内，细胞示踪显示移植的UCMSC长期存活并迁移至生精小管基底膜，同时表达生殖细胞标志物，提示UCMSC移植入体内后能进一步向生殖细胞分化，生精小管的组织结构亦得到明显修复［31］。另有研究表明，UCMSC移植进动物体内后，并不能直接分化为精原细胞，更可能是通过旁分泌作用分泌营养因子，促进精子发生过程［32］。
MSC治疗男性不育的临床前研究
近些年MSC已被广泛应用于男性不育的临床前研究，MSC动物体内移植后能够长期存活并增殖，并迁移至生精小管基底膜，分泌营养因子，同时分化为生殖细胞和支持细胞，改善局部生精微环境，修复不育动物的生精功能。
表2 MSC治疗男性不育的临床前研究进展[16]。
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MSC治疗男性不育的临床研究目前仍处于起步阶段，截止到目前为止，美国Clinical Trials网站上MSC治疗男性不育的研究有6项，国内临床试验注册中心尚无MSC治疗男性不育的相关研究，涉及的成体干细胞主要采用BMMSC、ADMSC，均处于临床Ⅰ/Ⅱ期（见表3）。
表3 MSC治疗男性不育的临床前研究
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MSC的安全性
干细胞体内移植后，能够归巢到病灶部位发挥治疗作用，但由于分化方向的不可控性，其安全性问题引发了人们的广泛担忧。这其中人们最关注的是干细胞的致瘤性。目前，学术界普遍认为，胚胎干细胞和诱导多能干细胞存在致瘤性风险。而截止目前尚未有MSC具有致瘤性的报道。
Yun等［40］将UCMSC注射入C57BL /6 小鼠体内，26周后，实验动物均未长瘤。Lee等［41］使用MSC移植治疗缺血性脑中风患者，患者生存时间、生活能力评分均明显获益，长期观察未发现有致瘤性。Wakitani等［42］对41例软骨损伤的患者输注 MSC进行治疗，随访11年，均未发现肿瘤的发生。最新研究显示，无论是自体还是异体MSC(骨髓、脂肪、脐带或胎盘来源) ，动物和人体临床研究均未见严重不良反应，未发现与移植有关的肿瘤形成［43］。众多研究表明，MSC的致瘤性风险极低。另外，全球范围内开展的多项临床试验均证实了MSC临床应用的安全性，且多个国家已经批准MSC上市。
展望
目前，全球范围内已有十余个干细胞药物上市，主要应用于移植物抗宿主病、心肌梗死、骨关节炎和肌萎缩侧索硬化症等适应症。但MSC在男性不育领域的研究多处于临床前研究阶段，应用于临床仍需一些时间。相信随着研究的不断深入，未来MSC能成为临床上治疗男性不育的有效手段。
参考文献：略
— 延伸阅读 —
细胞王国
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