间充质干细胞外泌体应用于组织再生的前景
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Overview 综述
导语：组织再生是指用新生组织替代或修复人体坏死、受损或老化组织。外泌体是真核细胞分泌的一种细胞外膜性微囊泡，作为干细胞旁分泌活动的一种重要方式参与组织再生。外泌体的应用为组织再生提供了一种新策略。
单位：中国医科大学口腔医院儿童口腔科
作者：蒋欢 刘尧 陈旭
间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）广泛存在于多种组织和器官中，是一种具有自我更新和多种分化潜能的前体细胞。借助再生医学技术，使受损的组织器官获得再生，或在体外复制出所需要的组织或器官进行替代治疗，已成为生物学和医学关注的焦点。组织再生主要有2种治疗策略：
（1） 无细胞性治疗，应用生物活性支架或细胞因子，募集自体的干细胞并且调控干细胞功能从而促进受损组织修复再生；
（2） 以细胞为基础的治疗，联合应用足够数量的外源性干细胞、生物活性支架和细胞因子，以达到组织的修复与再生［1］。
最初认为MSCs能够聚集到损伤组织处，通过自我更新，定向分化替代受损的细胞；然而最近的研究［2-3］表明在损伤处MSCs分化较低且并不稳定，同时移植的MSCs大部分发生了凋亡，并未直接参与组织再生。有证据表明MSCs的旁分泌作用可能是其在组织再生中的重要机制［4］。
外泌体临床应用前景。
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外泌体临床应用前景。例如：骨髓间充质干细胞衍生的外泌体在以下方面的治疗益处和作用机制:(a)各种心脏疾病，(b)肾损伤，(c)肝损伤，(d)肺损伤，(e)伤口愈合。
细胞分泌的细胞外囊泡（extracellular vesicles，EV） 或者微囊泡是细胞相互交流的一种方式，作为干细胞旁分泌活动的重要方式，在组织再生中发挥重要作用［5］。其中，外泌体是微囊泡中的一种，近年来研究［2］表明MSCs来源的外泌体 （MSC-Exo）与MSCs有着相似的功能，包括修复与再生组织、抑制炎症反应及调节机体免疫。
间充质干细胞来源的外泌体
细胞外囊泡或微囊泡最早被认为是细胞移除代谢废物、维持细胞内稳态的一种机制，而目前认为它还是细胞相互交流的一种重要方式，能够被大多数类型的细胞释放和胞吞［6-7］。外泌体是细胞外微囊泡中的一种，直径为40~100 nm，包被细胞的双层脂膜结构，包含生物活性的脂质、蛋白、受体、mRNA、microRNA（miRNA）、长链非编码RNA以及完整的细胞器，例如线粒体［1］。四跨膜蛋白CD9、CD63、 CD81和CD82是外泌体常用的分子标志物［8］。
间充质干细胞分泌的囊泡类型和组成
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外泌体所包含的RNA（包括编码mRNA、miRNA、tRNA）被认为是调节受体细胞活动的主要物质［7，9-10］。其中miRNA是细胞间交流的主要调节物质，能够通过自身的降解和再表达来调节受体细胞的基因表达。细胞中RNA的表达谱特征不具有供体和组织特异性，然而外泌体中所含的RNA却较大程度地受细胞类型和分化状态的影响，不同组织来源的MSC-Exo具有不同的性能；MSC-Exo中的RNA或者蛋白能够发挥细胞归巢作用并调节细胞的增殖与分化，可以限制损伤、调节免疫反应以及促进细胞损伤后的自我修复和组织再生［10-12］。
外泌体的电镜照片。
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间充质干细胞外泌体在不同组织再生中的应用
｜01 神经系统再生
间充质干细胞外泌体对于神经系统疾病和神经变性疾病显示出治疗优势。魏俊吉等［13］用P12细胞建立谷氨酸神经细胞损伤模型，用脂肪间充质干细胞外泌体处理损伤细胞，结果显示外泌体中含有大量的对大脑损伤有一定保护作用的细胞因子，如胰岛素生长因子和肝细胞生长因子，能够提高损伤细胞的存活率，其作用机制可能是外泌体通过PI3KAkt通路实现对神经损伤的保护作用。有学者［14］建立了小鼠创伤性脑损伤模型，通过小鼠尾静脉注射MSC-Exo后，发现小鼠认知和感觉运动功能恢复、齿状回中新形成的成神经元细胞和成熟神经元细胞数目增加、损伤边缘区域和齿状回中新形成的内皮细胞数目增加及大脑炎症反应降低。应用小鼠中风模型研究［15］发现静脉注射MSC-Exo后促进了神经突重塑、神经再生和血管再生，从而促进神经功能恢复。将骨髓间充质干细胞来源的外泌体注射到视神经损伤小鼠的玻璃体中，外泌体可以从玻璃体迁移到节细胞层，促进受体细胞（视网膜神经节细胞）存活和轴突再生［16］。
阿尔兹海默病一种神经退行性病变，其特征性表现是β-淀粉肽在脑中沉积，脑啡肽酶是脑中最重要的β-淀粉肽降解酶。脂肪间充质干细胞来源的外泌体能够携带高水平的脑啡肽酶，与高表达β-淀粉肽的成神经细胞瘤细胞共培养时，能够降低细胞内、外的β-淀粉肽，这提示了脂肪间充质干细胞来源的外泌体可能有效治疗阿尔兹海默病［17］。另有研究［18］表明，脱落乳牙干细胞来源的外泌体能够抑制6-羟基多巴胺诱导的多巴胺能神经元凋亡，提示以MSC-Exo为基础的治疗方式可能成为帕金森病一种新的选择。
｜02 心血管再生
自2010年LAI等［19］首次报道MSC-Exo可以作为一种心脏保护剂以来，近年来越来越多的研究证明了MSC-Exo应用于心血管疾病的可行性及有效性。MSC-Exo可以促进心脏干细胞增殖、迁移以及血管生成，将用MSC-Exo预处理过的心脏干细胞局部注射移植到心肌梗死区域后，增加了梗死区域毛细血管密度、减少了心肌纤维化并且保护了心脏功能［20］。体外试验发现MSC-Exo能够促进内皮细胞增殖、迁移和血管形成；体内试验应用小鼠急性心肌梗死模型，在心肌内局部注射MSC-Exo能够显著促进血流恢复、减小梗死区域范围、保护心脏收缩和舒张功能［21］。蛋白激酶B（protein kinase，Akt）能够促进细胞增殖、抑制凋亡，转染了Akt的人脐带间充质干细胞外泌体（Akt-Exo）体外能够促进内皮细胞迁移、增殖和管样结构形成，而将Akt-Exo通过尾静脉注入急性心肌梗死小鼠中，发现其更利于血管生成和心脏功能提高。Akt-Exo中高表达的血小板源性生长因子可能在血管再生中发挥重要作用［22］。
有学者发现在心脏修复中，MSC-Exo比MSCs有更好的治疗效果，并通过2者miRNA测序比较分析了MSC-Exo促进心脏修复的可能机制，发现两者有着相似的RNA表达谱，例如，均促进miR-29和miR24表达，抑制miR-34表达，这些均利于上调心脏功能；但MSC-Exo中miR-21和miR-15表达却明显低于MSCs，其中miR-21下调可以防止心肌肥大，miR-15的抑制能够防止心脏缺血性损伤，这在一定程度上解释了MSC-Exo发挥治疗效果的原因［23-25］。
｜03 肾脏损伤修复
有学者［26］报道干细胞来源的条件培养基能够促进缺血性肾损伤恢复，提示干细胞分泌的可溶性细胞因子或者外泌体具有治疗肾脏损伤的可能性。研究［27］将人脐带间充质干细胞的外泌体注入急性肾损伤小鼠的肾囊内，发现它能够减少有害物质形成，抵抗药物诱导的氧化反应，抑制肾细胞凋亡，并通过激活ERK1/2通路促进肾细胞增殖，最终减轻顺铂诱导的肾脏损伤。另有研究［28］应用小鼠肾脏缺血再灌注模型比较脂肪间充质干细胞、脂肪间充质干细胞来源外泌体以及两者联合应用的效果，发现单独应用外泌体即能达到减轻肾缺血再灌注损伤，两者联合应用也比单独应用干细胞更能减轻肾脏功能的恶化和保护肾结构的完整性。在肾脏缺血再灌注损伤时，趋化因子C-C模体趋化因子配体2（C-C motif chemokine ligand 2，CCL2） 通过与其主要受体C-C模体趋化因子受体2 （C-C motif chemokine receptor2，CCR2） 的结合募集大量的外周血单核细胞和巨噬细胞，导致肾脏炎症损伤［29］。而MSC-Exo富含膜CCR2，局部应用后能够消耗肾损伤处自由状态下的CCL2，减少炎症细胞浸润，减轻炎症反应，最终促进肾脏损伤修复［30］。
｜04 肝脏损伤修复
多种因素（病毒性肝炎、药物、酒精、代谢类疾病等）可以导致肝脏损伤，MSC-Exo已经作为肝脏损伤修复的一种治疗选择。有学者［31］用四氯化碳诱导小鼠肝脏纤维化后，通过肝脏内直接注射人脐带间充质干细胞外泌体，发现能够降低肝细胞转化生长因子TGF-β1的表达、通过阻断Smad2信号通路磷酸化，逆转肝细胞表皮间充质转化，最终减少胶原沉积，促进肝脏损伤修复。
此外，HERRERA等［32］证明干细胞来源的微囊泡可以促进肝脏细胞增殖，并且在小鼠肝脏切除后能够促进肝脏组织再生。在四氯化碳诱导小鼠肝损伤的动物模型中，应用MSC-Exo可以促进损伤后的肝脏再生；在相应的体外研究中，发现MSC-Exo能够恢复因过氧化氢和对乙酰氨基酚导致细胞活性的损伤［33］。在肝脏缺血再灌注模型中，静脉注射MSCExo能够抑制受损区炎症细胞浸润、减少炎性细胞因子释放、减轻氧化应激，最终达到降低肝细胞凋亡、坏死和减轻肝脏损伤的效果；同时，MSC-Exo能够促进肝脏细胞损伤后增殖［34］。谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物酶是主要的内源性抗氧化剂，MSCExo中含有大量的谷胱甘肽过氧化物酶，能够抑制过氧化氢和四氯化碳所引起的肝细胞的氧化应激和凋亡，其中的机制可能是ERK1/2、Bcl-2上调 和IKK8/NF-κB/casp-9/-3通路下调［35］。
｜05 骨、软骨及骨骼肌再生
MSC-Exo可以促进成骨细胞的增殖和分化，这提示它在骨修复或骨组织再生中的潜能［36］。FURUTA等［37］应用CD9-/-小鼠建立骨折延迟愈合的动物模型，由于结痂受到阻碍，CD9-/-小鼠的骨愈合率明显低于野生型小鼠；而注射MSC-Exo能够促进软骨内成骨，加速骨折愈合。另有学者［38］将人诱导多能干细胞定向分化为间充质干细胞（human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells，hiPS-MSC），并提取其外泌体与磷酸三钙支架联合应用，发现其可以促进小鼠颅骨缺损处的骨再生，与此同时在体外细胞实验中发现，hiPS-MSC-Exo可以被人骨髓间充质干细胞胞吞，并促进细胞的迁移、增殖和成骨分化。将人胚胎MSC-Exo以及成体人MSC-Exo注入软骨缺损小鼠的关节内，12周后发现关节表面形成了平滑连续的透明软骨层以及软骨下骨的再生，而对照组 （关节内注射生理盐水或磷酸缓冲盐溶液）只形成纤维修复［39-40］。
此外，在心脏毒素诱导小鼠骨骼肌受损模型中，局部注射MSC-Exo后组织学结果显示，与对照组比较，实验组纤维区域减小并且有大量肌纤维、毛细血管形成，说明MSC-Exo能够促进骨骼肌再生［41］。
｜06 口腔组织再生
牙髓感染或坏死的传统治疗方法 （根管治疗、根尖屏障术等） 以生物材料替代有活力的牙髓，而牙髓血管再生治疗仅能在根管内形成牙骨质样、骨样组织和牙髓样、牙周膜样结缔组织，未能实现真正意义上的牙髓再生［42］。依据组织工程三要素，要真正实现具有生理性功能的牙髓再生，干细胞及支架材料的选择以及局部微环境的诱导 （细胞因子的选择）是亟待解决的问题，而外泌体含有丰富的生物活性因子，能够替代单一的细胞因子，在牙髓再生中发挥重要的作用［43］。用常规培养基及成牙本质条件培养基分别培养牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs） 4周，提取上清中外泌体，实验分为常规培养DPSCs分泌的外泌体组（DPSC-Exo组 和成牙本质诱导后DPSCs分泌的外泌体组 （DPSC-ODExo组），将DPSCs与提取的外泌体接种在Ⅰ型胶原膜上形成复合物，将复合物置于长约3~4 mm的牙根片段内，植入裸鼠背部皮下。2周后免疫组化染色显示，在牙根内表面与软组织接触处，2组均高表达基质矿化和细胞成牙本质向分化的关键调节因子DMP1和DPP，其中DPSC-OD-Exo组蛋白的表达量更多［44］。此外，免疫荧光染色显示在再生的牙髓样组织中，DPSC-Exo及DPSC-OD-Exo均使多种蛋白（促血管生成因子PDGF和转录因子Runx2）的表达水平提高。体外研究［45］也发现外泌体可能激活P38促分裂原活化蛋白激酶 （P38 mitogen activated protein kinase，MAPK） 通路，促进DPSCs以及骨髓MSCs的成牙本质向分化。以上研究提示外泌体可能作为一种生物工具应用到牙髓再生中，为牙髓坏死或牙髓炎提供新的治疗策略。
｜07 其他组织再生
MSC-Exo能够呈剂量依赖性地促进成纤维细胞迁移、增殖和胶原合成。在小鼠皮肤切口模型中，静脉注射外泌体后，外泌体可以被募集到软组织创伤区，通过改变成纤维细胞的性能，在创口愈合的早期促进Ⅰ、Ⅲ型胶原形成，晚期则抑制胶原表达从而抑制疤痕形成，最终促进皮肤创口愈合［46］。
间充质干细胞外泌体在组织再生中的应用前景
在再生治疗中，外泌体可以避免干细胞治疗的一些缺陷（免疫排斥、伦理问题等），并且外泌体具有高稳定性、易于储存、无需增殖、便于定量使用以及向损伤处募集等优势；外泌体因其包含多种蛋白和RNA，与某种单一的细胞因子比较具有较高的安全性和更大的组织再生潜能。因此，MSC-Exo在组织再生中具有极大优势［16，45］。虽然MSC-Exo具有较好的应用前景，但是外泌体的提取方法及其复杂的分类系统阻碍了它的应用，外泌体高效提存技术成为临床应用前的有待解决的重要问题。在目前动物实验局部注射MSC-Exo后损伤处外泌体的浓度未知，外泌体促进组织再生或者免疫调节时的最佳浓度，外泌体的半衰期也需要更深入的研究。此外，因为由不同细胞或者同一细胞不同生理状态下分泌的外泌体可能存在差异，外泌体发挥作用的内容物及机制需要更深入研究。同时外泌体转运多种生物分子，如何在体内调节受体细胞、改变细胞的状态和命运也尚未可知。