外泌体联合间充质干细胞移植有效促进心脏修复

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2022年2月7日发表的一篇题为：Sequential transplantation of exosomes and mesenchymal stem cells pretreated with a combination of hypoxia and Tongxinluo efficiently facilitates cardiac repair的研究，初步揭示了间充质干细胞及外泌体联合应用在心脏修复方面的潜力，本公号将主要部分进行原创编译，分享给读者。

具有免疫调节特性的间充质干细胞（MSCs）是治疗急性心肌梗死（AMI）的有希望的候选。然而，MSCs 在缺血性心脏中较低的保留率和存活率限制了它们的治疗效果。改变MSCs或减轻炎症环境的策略，促进了移植的 MSCs的归巢和存活，可能会解决这个问题。因此，我们旨在探索连续移植外泌体和联合预处理的MSCs治疗AMI的疗效。

心血管疾病 (CVD)，包括急性心肌梗死 (AMI)，在全球上仍然是发病率和死亡率偏高的主要原因 _[1,2,3]。心肌梗死损伤会引发心肌细胞突然大量丢失并伴有强烈的炎症反应，这可能导致心脏功能恶化、梗死和心力衰竭 _[4,5]。干细胞治疗被认为是促进心脏修复的一种有前途的策略_[6,7,8]。

基质细胞衍生因子1 (SDF-1)/CXC趋化因子受体4 (CXCR4) 轴在促进心肌修复和缺血性损伤后将干细胞募集到梗塞心肌中起关键作用 _{[17,18,19,20,21,22,23 ]}。已证实SDF-1 的心肌表达在AMI早期达到峰值，随后几天降至相对较低的水平_[17,24,25]。因此，早期移植间充质干细胞可以达到更高的保留率。然而，在AMI的同一早期阶段，会发生强烈的炎症反应，并释放大量炎性细胞因子，这对移植细胞的存活来说是灾难性的。提高SDF-1水平同时限制炎症水平可能会促进移植细胞的募集和存活，从而提高其治疗效果。

外泌体是30-150nm的细胞外囊泡，含有各种生物活性蛋白和RNA，在细胞之间的通讯中至关重要 _[26,27]。据广泛报道，它通过提高细胞存活率 _{[28,29,30,31]} 、改善炎症_[32,33,34]和增加心肌SDF-1表达水平_[35]，使其在梗塞心脏的早期阶段，促进心脏恢复方面表现出明显的益处。此外，许多策略包括药物预处理 _[36,37] 、缺氧预处理_[38,39]、基因修饰_[40,41,42] 和组织工程 _[43,44] 都已被开发用于增强MSCs的治疗效果。

在这些方法中，染色剂和通心络（TXL）等药物预处理以及低氧预处理被广泛使用，也具有临床转化的潜力。TXL是一种中药复方，能够保护MSCs免受缺氧损伤_{[ 45]}。此外，缺氧预处理可以增强MSCs在心肌损伤治疗中的疗效_[39,46]。尚未探索缺氧和TXL预处理的组合策略是否可以更好地增强MSCs的治疗效果。

在本研究中，我们首先探讨了连续递送外泌体和联合预处理的MSCs在治疗AMI中的心脏保护作用，并进一步研究了联合预处理与缺氧和TXL对MSCs的影响。

在AMI的早期移植外泌体改善了炎症，减少了细胞凋亡，增加了心肌SDF-1，从而为MSCs的存活和募集创造了更好的微环境。同时，低氧和TXL联合预处理提高了CXCR4的表达水平，提高了MSCs的保留率。用缺氧和TXL预处理的外泌体和MSC的移植使受损心脏得到恢复。因此，我们的数据表明，连续移植外泌体和预处理的MSCs显著促进了心脏修复。

01

外泌体减少炎症

和细胞凋亡

首先在AMI后30分钟将PBS（100μL）或PKH26标记的外泌体（20μg，在100μL PBS中）注射到梗塞周围的心肌中。与AMI组相比，外泌体递送显著降低炎症细胞因子水平，如TNF-α和IL-6的ELISA 结果所示（图1 E、F）。

与之前的报道一致 _[35,36]，ELISA结果显示，AMI组梗死周围心肌中的SDF-1水平在梗死后第1天达到峰值，然后在第一周内迅速下降至低水平。相反,外泌体递送增强了SDF-1水平并在第3天将其维持在相对较高的水平，尽管它在第7天降至较低水平（图1 G）。在AMI后第3天，共聚焦图像表明 PKH26 标记的外泌体仍保留在心肌中（图1H），与在AMI组中观察到的相比，外泌体递送显著减少了凋亡细胞的数量（图1H）。

综上所述，在梗死后第3天，心肌内注射外泌体使炎症水平降低，心肌SDF-1表达水平升高，梗死边界区细胞凋亡减少，使其成为MSCs移植的合适时机。因此，我们选择梗死后第3天递送MSC,以评估联合预处理在调节MSC治疗效果方面的作用。

02

外泌体联合预处理MSC

改善梗死后的心脏功能

为了评估联合预处理的MSCs是否发挥更好的治疗效果，首先在心肌梗死损伤后30分钟将外泌体注射到心脏，然后通过尾部注射MSCs（包括MSC、MSC H、MSC T或 MSC C） AMI后第3天的静脉（图2A）。与AMI组相比，Exo组在第28天显著改善了AMI引起的LV扩张，并且联合分娩治疗发挥了更好的效果（图2 B）。AMI组LVEF和LVFS明显下降，表明心功能恶化。外泌体和 MSC的连续移植导致LVEF和LVFS显著升高，而Exo + MSC C在所有共同移植组中，显示出心脏功能的最高改善（图2 C-F）。

03

外泌体联合预处理MSC

减少心肌梗塞面积

由于外泌体和联合预处理的MSCs治疗实现了心脏功能的提高，我们进一步评估了梗死面积和胶原面积。在AMI后4周，与Exo组相比， Exo+MSC H、Exo+MSC T和 Exo+MSC C组的梗塞面积减小。在三组中，与Exo+MSC H和 Exo+MSC T组相比，Exo+MSC C组的梗死面积较小（图3 A、B）。总之，这些结果表明，连续递送外泌体和组合预处理的MSC减少了梗死面积和胶原蛋白面积，而Exo+MSC C可能是治疗AMI的最佳移植策略。

04

外泌体联合预处理MSC

增强血管生成

为了评估外泌体和组合预处理的 MSCs 递送是否诱导缺血性心脏的形态学变化，我们分别通过量化α-SMA染色（图4 A、B）和CD31染色（图4 C）测量了小动脉和毛细血管的密度。与在AMI 组中观察到的相比，单独的外泌体移植以及所有联合移植治疗均实现了增加的小动脉和毛细血管密度。值得注意的是，Exo+MSC C在所有组合治疗中表现出最高的小动脉和毛细血管密度。

05

低氧处理

增强MSCs的作用

为了更好地阐明Exo+MSC C卓越的心脏保护作用的机制，我们通过荧光染料追踪评估了移植的MSC在梗塞心肌中的保留率。在递送PKH67标记的外泌体后第3天，通过尾静脉注射CM-Dil标记的MSC。与单个MSC组相比，外泌体和MSC的联合递送显示出更高百分比的 CM-Dil +细胞。并且在 Exo+MSC C组中发现的CM-Dil +细胞明显多于其他组合组，表明募集率更高（图5）。

总的来说，这些结果表明，低氧和TXL联合预处理增加了移植的MSCs的保留。由于SDF-1/CXCR4轴对于将MSCs募集到梗塞心肌中至关重要 _{[49,50,51 ]}，我们进一步研究了组合预处理对MSCs中CXCR4水平的影响。在与缺氧和TXL联合预处理后，MSCs中CXCR4的mRNA和蛋白质水平均显著升高（图5C- E）。

06

外泌体保护MSCs免受

缺氧诱导的细胞凋亡

为了进一步确定外泌体预注射对移植的MSCs的影响，我们用外泌体预处理MSCs 24小时。PKH-26标记的外泌体可在孵育24小时后被MSCs 吸收（图5 F）。如流式细胞术所示，与 H/SD和H/SD + Exo (Ultra) 组相比，Exo组的MSCs 凋亡显著减少，其中外泌体通过超声处理破裂（图5 G,H）。此外，在H/SD条件下，Exo 处理显著提高了抗凋亡蛋白Bcl-2的水平并降低了MSCs的促凋亡裂解caspase 3水平（图5 I-L）。总的来说，这些结果表明外泌体有效地保护MSCs免受缺氧诱导的损伤。

尽管各种类型的干细胞似乎是促进缺血性损伤后心脏修复的有希望的策略，但移植细胞的低保留率和较差的存活率限制了它们在AMI治疗中的治疗效果 _[12,13]。外泌体移植已被证明可以改善炎症并保持心脏功能 _{[ 28,29,30,31,32]}。因此，我们探索了外泌体递送是否可以改善恶劣的微环境以促进干细胞的募集和存活，并且我们研究了低氧和TXL联合预处理是否可以更好地增强移植的MSCs的效果。

主要发现如下：

（1）外泌体递送显著增强了梗死周围心肌中SDF-1的表达，在AMI后第3天炎症有限，细胞凋亡减少；

（2）外泌体注射后连续递送间充质干细胞显著促进心脏修复；

（3）低氧和TXL联合预处理增加了CXCR4水平，增加了移植的MSCs的募集，达到了最好的治疗效果(图6 )。

作为一种有前途的促进心脏修复的无细胞疗法 _[52,53]，来自MSCs的外泌体已被发现具有抗凋亡 _[28,29,31]、抗炎_[32,54]以及促血管生成效应_[55,56]，所有这些对于恢复梗塞心肌的功能至关重要。然而，短的半衰期和温和的疗效限制了外泌体的治疗应用 _[53,57]。在这项研究中，我们证明了早期注射外泌体可有效改善炎症、减少细胞凋亡并提高AMI后第3天SDF-1的表达水平。此外，外泌体预处理有效地保护了MSCs免受缺氧损伤。

总的来说，随着炎症、细胞凋亡和SDF-1水平的增加，AMI后第3天是连续移植MSCs的合适时间。预处理的心脏干细胞 (CSCs)与源自MSCs的外泌体(MSC-Exo)和MSC-Exo预处理的CSCs 显着增强血管生成、减少心脏纤维化和提高心脏功能_[58]。石等人还报道了用MSC-Exo预处理CSC可增强缺血心肌的治疗效果_[59]。因此，源自MSCs的外泌体可用作促进干细胞介导的心脏修复的新治疗载体。

干细胞疗法是增强心肌修复的一种有前途的策略，但其临床应用受到移植细胞的低保留和较差的存活率的限制。近年来，已经开发出新的策略，包括MSCs修饰和联合细胞疗法，以提高基于干细胞的疗法的疗效 _[68,69]。在这项研究中，我们发现外泌体的连续移植和组合预处理的MSCs进一步促进了心脏恢复。

尽管心脏修复的效果仍有待在临床前和临床研究中进行检验，但目前的进展表明干细胞疗法在促进缺血性损伤后心脏修复方面具有广阔的潜力。考虑到巨大的潜力，不断探索开发新的基于细胞的方法，例如将干细胞和外泌体与生物材料相结合，以及不同干细胞类型的组合使用，可能有助于更好的实现心脏修复的目的。

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