间充质干细胞外囊泡：一种有前途的骨质疏松症替代疗法
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撰文｜摩西
编辑｜南风
骨质疏松症是一种由骨形成和骨吸收失衡而引起的代谢性骨骼疾病，通常发生在绝经后妇女和老年人中[1]。
双膦酸盐、选择性雌激素受体调节剂 (SERM) 和降钙素仍是治疗骨质酥松的常见疗法。其中双膦酸盐（阿仑膦酸盐、利塞膦酸盐、唑来膦酸、伊班膦酸盐）在临床前和临床中被广泛用作骨质疏松症的一线治疗用药，但双膦酸盐引起的多种副作用仍需重视[5,6,7,8]。双膦酸盐的常见副作用包括肌肉疼痛、胃灼热、恶心、胃溃疡和吞咽困难。与药物相关的颌骨坏死 (MRONJ) 很少见，但它是最严重的副作用[9]。因此，研究人员一直在寻找疗效更好、副作用更少的骨质疏松症替代疗法。
骨的重塑过程主要由破骨细胞和成骨细胞参与，其他细胞包括骨细胞、骨衬细胞、单核细胞、软骨细胞、造血干细胞和间充质干细胞 (MSCs) [2,3,4]。间充质干细胞已被证明是治疗多种人类疾病（包括许多难治性疾病）的有前途的细胞药物。最近，研究人员发现，源自间充质干细胞的细胞外囊泡（MSC-EV）具有与亲代细胞相似的治疗潜力。迄今为止，许多研究相继证明了外源性 MSC-EV 在治疗骨质疏松症中的应用价值。
外泌体科普视频
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携带疾病治疗分子的间充质干细胞外囊泡
细胞外囊泡 (EV) 是由几乎所有细胞类型分泌的纳米至微米级囊泡。它们可以按大小、生物发生、释放途径、封装内容和功能分为三个亚组：外泌体（30-200 nm）、微泡（MVs，45-1000 nm）和凋亡小体（ABs，1-4μm）[28,29]。
根据 MISEV（minimal information for studies of extracellular vesicles）2018 指南，“细胞外囊泡（EVs）”是一个专家共识术语，用于描述具有以下特征的囊泡：（1）囊泡不能复制。(2)囊泡从细胞中自然释放出来。(3) 囊泡被脂质双层包裹。EV应具有至少三个阳性标志物（包括一种跨膜/脂质结合蛋白）和一个阴性标志物的特征。
细胞外囊泡转运蛋白质和RNA示意图
已有研究表明 MSC-EV 在治疗各种疾病方面具有与MSC相似的潜力 [32,33]。外泌体被脂质双层膜包裹，外泌体膜内有几种类型的分子，包括整合素、粘附分子、脂质和某些受体。在外泌体内部，包裹着各种类型的分子，包括DNA、信使RNA、microRNA、非编码RNA、酶、细胞因子以及许多其他蛋白质 [14]。
典型的外泌体(40- 80nm)电子显微图(A和B)。图A中的箭头表示该外泌体膜表面有CD63
所有这些物质都是通过外泌体运输和受体细胞摄取参与细胞间通讯的材料。此外，不同类型的细胞会产生不同含量的外泌体，具有不同的作用。外泌体是负责从细胞中运输大部分分泌因子的主要载体，这也是其“快递员”或者“货拉拉”比喻的由来[15]。
总的来说，MSC-EVs在治疗多种疾病模型中显示出不低于亲本MSCs的治疗潜力，表明MSC-EVs是值得开发的药物。
外源性MSC-EVs在骨病治疗中的应用。( A ) MSCs及其分泌的EV已成功用于治疗股骨头坏死、OA、RA、骨肉瘤和骨质疏松症。( B ) 外源性MSC-EV对骨质疏松症的延缓可能归因于携带的货物（蛋白质和非编码 RNA），或者是由工程化 MSC-EV 达到的。
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改良的细胞外囊泡的临床应用
修饰细胞外囊泡的方法有很多，将外源蛋白质或核酸加载到细胞外囊泡中是常用方法。为了增加细胞外囊泡的获取数量，在缺氧环境中培养的细胞分泌的细胞外囊泡比在常氧环境中培养的细胞多1.5-2倍[62]。其他细胞外囊泡工程化方法包括：表面修饰、磷脂结构域结合、混合细胞外囊泡与脂质体等，从而增强细胞外囊泡的结合能力、靶向能力和稳定性，并增强治疗效果 [63,64,65,66,67]。
总而言之，对细胞外囊泡进行适当的修饰和工程化在不同程度上增强了治疗潜力，例如增强靶向能力或加载治疗剂。
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外源性间充质干细胞外囊泡
治疗骨质疏松症的潜力
通过调节骨形成和吸收 重新平衡骨稳态
迄今为止，使用MSCs或MSC-EVs治疗代谢性骨病的策略主要集中在通过促进成骨细胞和抑制破骨细胞来调节骨重塑。MSC-EV 被证明有利于诱导成骨或抑制破骨细胞生成。例如，治疗源自人牙髓干细胞 (hDPSCs) 的EV通过靶向MAPK通路促进脂肪干细胞 (hADSCs) 的成骨化[82]。
通过micro-CT、共聚焦激光扫描显微镜和组织学染色来验证hDPSC-EVs 对成骨能力的影响。图为显微CT图像拍摄移植后至数周的骨量变化。
源自成骨分化的 hADSC 的 EV 显示出增强的诱导 hADSC 成骨的能力。尽管这些临床前研究取得了可喜的结果，但与MSCs相比，迄今为止，MSC-EVs 在治疗骨病方面的进行的临床试验还很少（表1）。这表明MSC-EVs在骨疾病中的应用仍处于起步阶段，需要更多关于治疗效果、靶向信号通路和其他机制的证据。
在 Clinical Trials.gov 上注册的正在进行的 MSC 和 MSC-EVs 治疗骨病的临床试验
MSC-EV 携带的 miRNA 和 lncRNA 作为骨质疏松症药物
对于骨质疏松症的治疗，一些研究表明 miRNA 在 MSC-EV 中的治疗潜力。一份报告显示，在 MSC-EVs 中，发现了 171 个 miRNA，它们调节至少 5481 个基因并影响了许多信号通路[85]。来自脐带的MSC-EV在通过miRNA货物治疗骨质疏松症方面具有较好的潜力。一项研究（DOI：10.21203/rs.3.rs-37420/v1）宣称脐带MSC-EVs 的 miR-328-3p 和 miR-2110 促进了骨质疏松小鼠的骨形成。
MSC-EV 的蛋白质作为治疗骨质疏松症的治疗货物
2012年，通过从人类骨髓样本中提取EV，揭示了 MSC-EV 的蛋白质组学特征，该研究确定了730 种 EV 携带的蛋白质，并将其功能详细描述为 MAPK、TGF-β、PPAR、BMP、Wnt 和GF 信号通路 [96]。有趣的是，大多数提到的途径都与骨质疏松症的病理有关，它阐明了利用 MSC-EVs 递送特性开发骨质疏松症药物是值得追求的。随着对 MSC-EV 蛋白质组学分析的研究不断增加，迄今为止已鉴定出 3000 多种独特的蛋白质，为研究人员设计 MSC-EV蛋白质药物提供了明确的目标[97,98]。
外泌体携带的蛋白质。(a)液相-质谱（LC-MS/MS）检测3批独立的外泌体CM15、CM17和CM18的蛋白数量的维恩图。在CM15、CM17和CM18中分别检测到379,432和420个蛋白。结合蛋白数为766。(b)维恩图为LC-MS/MS和抗体阵列检测的蛋白质重叠部分。在CM15中通过抗体阵列检测到101个蛋白。101个蛋白中有10个与LC-MS/MS检测到的蛋白重叠。(c)之前在MSC条件培养基中鉴定的739个蛋白与纯化的外泌体中鉴定的857个蛋白的交集。
许多研究报告了MSC-EV 治疗骨质疏松症的治疗潜力。在一项评估人脐带间充质干细胞衍生的细胞外囊泡 (hucMSC-EVs) 对OVX（骨质疏松症）小鼠的治疗效果的研究中。通过液相-质谱（LC-MS/MS）分析共鉴定出5570种EV携带蛋白，该小组成功地证明了hucMSC-EVs（通过转移CLEC11A）延缓了骨质疏松症。MSC-EVs不仅刺激祖细胞分化为成骨细胞，还参与了破骨细胞生成的调节 [99]。
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MSC-EV 在骨质疏松症治疗中的改造
尽管 MSC-EV 能够通过细胞内递送有益货物来促进血管生成、抑制免疫反应和支持祖细胞，但其他因素，如体内稳态、靶向能力和异质群体可能会影响治疗效果。研究表明，可以通过适当的工程化或修饰来增强 EV 的治疗效果。例如，与 RGD (Arg-Gly-Asp) 肽水凝胶结合的 MSC-EV 可以增强急性肾损伤 (AKI) 修复的效果。肾内注射后，与非工程化 MSC-EVs 相比，工程化 MSC-EVs 避免了经体内循环的快速清除，表明 RGD 修饰显着提高了稳定性并延长了 MSC-EVs 的体内保留时间 [113]。
另一组从用脂多糖（LPS pre-Exo）预处理的细胞中分离出 MSC-EV，加速了糖尿病大鼠的皮肤伤口愈合。
未经修饰的MSC-EVs能够在体外诱导BMSCs成骨细胞分化，而在体内延缓OVX小鼠骨质疏松症的进展方面效果不佳。然而，适体缀合的MSC-EV的全身给药，OVX小鼠的成骨活性增强，骨质疏松症显着改善。这种疗效可能通过 MSC-EV 携带的 miR-26a 发挥作用 [119]。总之，这些结果表明MSC-EV经过适当修饰后，显著增强了治疗潜力。
外源性 MSC-EV 治疗骨质疏松症的体外和体内研究汇总
结论
总之，骨质疏松症通常发生在老年人群中，导致骨折风险增加和生活质量（QOL）下降。作为骨质疏松症的一线药物双膦酸盐治疗的疗效和不良反应并不令人满意。MSC 疗法现已在多种疾病的临床试验中得到广泛测试，包括骨质疏松症。MSC衍生的EVs提供了一种无细胞 MSC 治疗的策略，与其亲本细胞相比，具有更好的治疗潜力。
利用MSC-EVs进行无细胞治疗的研究进展迅速，有望在不久的将来成为骨质疏松症临床治疗方法。
参考文献：暂不提供
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