关于博鳌乐城发表的“NKM免疫细胞”研究的一些疑问
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撰文｜东海先生、摩西
编辑｜南风
前言 /
NK细胞疗法是一个很有前途的临床研究领域，对某些肿瘤患者具有良好的安全性和初步疗效。以NK细胞为基础的肿瘤免疫治疗领域已经到了一个激动人心的关头，但也不枉某些机构前置商业化，搞出一些让人百思不得其解的概念，在搏人眼球的同时狠敲吃瓜群众一笔智商税。
在交流中，经常被一些“新概念“刷新认知，昨日笔者在某社群发现了这篇发表于今年8月份关于亚健康人免疫功能正常化的文章，非常感兴趣，虔诚地拜读和学习，发现这篇文章很有意思，有亮点，但也有明显的瑕疵，甚至有“夹带私货“的嫌疑。
为了让读者及社群成员更好地理解这篇文章，以及文中所提到的NKM细胞概念，本文做了一些梳理和点评。
这篇文章的研究内容总体上可以分为3部分：
（1）根据外周血单个核细胞（PBMC）的PD-1的表达量来定义50岁以后的“亚健康”状态；
（2）混合的免疫细胞治疗肿瘤患者；
（3）混合的免疫细胞应用于亚健康人。
50岁以后的亚健康状态的定义
PD-1属于免疫细胞表面的抑制性小分子，在肿瘤患者中常常是高表达，后果就是抑制了免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤。PD-1单抗就是阻断了PD-1的抑制性信号，相当于松了刹车而继续踩油门，从而增强了免疫细胞对肿瘤细胞的攻击和杀伤。
基于这个获得诺奖的免疫学知识，作者利用流式细胞仪检测了外周血单个核细胞（PBMC）表达PD-1的比例。在作者早期的研究中发现10-20岁的年轻人，其PBMC表达PD-1的比例只有不到2%。这次检测年龄大于50岁的95名健康个体，其PD-1和CTLA-4的表达情况。20-50岁的健康个体表示有一点淡淡的忧伤，被忽视了。
「小知识点1」：PBMC，是peripheral blood mononuclear cells的首字母缩写，中文翻译为外周血单个核细胞，注意不能翻译为外周血单核细胞，单核细胞的英文专业词为monocytes。人PBMC主要包括淋巴细胞和单核细胞（比重为1.070左右），还有一些红细胞和多核白细胞（比重超过1.080），所以可以通过密度梯度离心的方法从外周血获得PBMC。
「小知识点2」：CTLA-4，和PD-1具有类似的作用，都是作为免疫检查点起作用并下调免疫应答，起到抑制信号的作用，在调节性T细胞中组成型表达。阻断CTLA-4有利于增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤，激活CTLA-4有利于治疗自身免疫性疾病。似乎CTLA-4比PD-1更有临床价值。
「小知识点3」：CD3表达于所有种类的T细胞，所有CD3+T细胞即表示总T细胞（pan-T）。
结果发现大于50岁的健康个体的NK细胞不表达CTLA-4小分子，而CD4+T细胞和CD8+T细胞有少部分表达PD-1，作者并没有在图5中给出具体的数值，即不知道CD4+T细胞和CD8+T细胞各自表达PD-1的比例是多少。
论文供图
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来源：参考资料1
「疑问1」：作者在NK细胞上检测了CTLA-4的表达量，为何不在CD4+T细胞和CD8+T细胞上检测CTLA-4的表达量，毕竟CTLA-4的作用和PD-1的类似的，都是抑制性信号分子。CTLA-4和PD-1都是抑制性信号分子，只根据PD-1来评价亚健康状态，是很不够科学性的。
「疑问2」：作者只提供了检测CD4+T细胞和CD8+T细胞各自表达PD-1的表达量（图5），尚缺乏PBMC中CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例数值，那么如何得到表达PD-1的CD4+T细胞和CD8+T细胞在PBMC中的比例数值，即CD3+CD4+PD-1+T/PBMC和CD3+CD8+PD-1+T/PBMC的比例数据无从得知。
外周血单个核细胞中PD-1表达的“亚健康个体”的鉴定
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来源：参考资料1
从图6来看，不好理解分布比例（distribution ratio）的含义是什么。从内容上来理解，很可能是PD-1表达量的比例。姑且按照PD-1表达量的比例来理解吧。
图6A，PD-1在CD3+T细胞（总的T细胞）的表达量比例还是很低，表达量超过4%的50岁以上的健康个体中，只有16个人，即16/95=16.84%，即作者在图6中标明有16.84%的个人出现CD3+PD-1+T/PBMC > 4%的情况，其中有9.47%的个体出现表达PD-1的CD4+T细胞占总的CD4+T细胞（即CD3+CD4+PD-1+T/CD3+CD4+PD-1+T > 10%）超过10%的情况。有37.9%的个体出现表达PD-1的CD8+T细胞占总的CD8+T细胞（即CD3+CD8+PD-1+T/CD3+CD8+PD-1+T > 10%）超过10%的情况。
「疑问3」：人为设定4%和10%的科学根据在哪里？为何是4%和10%，而不是3%或者8%或其他？这部分数据内容缺少统计学的介入和分析，而且样本量明显不足，才95个人，更没有对年龄进行分组检测和分析。总不能认为七八十岁的人和五十多岁的人，都具有一样的免疫细胞功能状态吧。
混合的免疫细胞治疗肿瘤患者
从图1A的流程图来看，PBMC培养为混合免疫细胞，工艺流程类似CIK或者NK。
NKM的工艺流程
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来源：参考资料1
然后作者对这群80%为T细胞的混合免疫细胞（只含20%的NK细胞）定义为“混合的NK细胞”（mix-NK cells）。这是谜一样的定义。有观点认为，这是妥妥的营销型“玩家”的套路。作者也提到NKM是a mixture of immune-cell types，即混合免疫细胞类型。其实，个人认为比较科学的命名为混合免疫细胞（mixed-immune cells，MIC），或者干脆为CIK。
某社群交流截图
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来源：群主提供
「疑问4」：图2，这群混合免疫细胞的细胞毒性杀伤实验，对照组选择没有经过培养刺激的PBMC。利用对照组来表明实验组的厉害，不选择常规的CIK或者NK，选择最弱鸡的PBMC来做对比，这是啥意思？这真的是很魔幻。作者在补充材料里面提到NKM和NK92（即纯的NK细胞）的杀伤力的对比，虽然NKM的杀伤力（细胞毒性）只有NK92的一般，而且在图3中作者还证明了从NKM中分离出来的NK细胞（纯的NK细胞），其杀伤力远远超过NKM，但是作者还是很开心的提到NKM的杀伤力比PBMC高出很多很多。既然NKM的杀伤力不如NK，那本篇文章研究NKM的意义何在？
「疑问5」：文章中提到的数据是混合免疫细胞（即作者定义的NKM细胞）中NK细胞占20%，但是图1D的流式数据显示50岁以上的人PBMC中的NK细胞含量高达37.67%（一般低于10%），而且图1G的流式数据显示NKM细胞中NK至少有90%的含量。这些相互矛盾的数据，该相信哪个？
NKM细胞的特征
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来源：参考资料1
混合免疫细胞（即作者定义的NKM细胞）用于肿瘤患者的治疗，11名恶性淋巴瘤患者（7名弥漫性大B细胞淋巴瘤患者、2名外周T细胞淋巴瘤患者、1名间变性大细胞淋巴瘤患者和1名霍奇金淋巴瘤患者），治疗过程如下所示。每位患者每次接受静脉注射（20–30）亿的 NKM细胞，每2周治疗一次，最多治疗6次。
NKM细胞潜在的抗肿瘤活性
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来源：参考资料1
治疗效果汇总表如下。所有患者均较好的耐受，不出现明显的不良反应。其中1例完全缓解和1例病情稳定，其他患者的病情改善不明显，但是生活质量大大提高。
NKM细胞的治疗效果
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来源：参考资料1
「疑问6」：纳入11名患者，经过NKM治疗后，却不统计肿瘤患者的生存期和更多的临床血液学和影像学指标，仅仅是治疗前淋巴瘤国际预后评分（IPI）。既然强调生活质量提高，也没看到有相关的生活质量评分表。
混合的免疫细胞应用于亚健康人
亚健康人群的选择标准；PBMC中CD3+PD-1+细胞大于4%，同时CD3+CD8+PD-1+细胞大于10%。一共入组了4名亚健康志愿者。
混合免疫细胞（即作者定义的NKM细胞）应用于亚健康人的方案如下，即每4周回输一次，连续3次，每次20亿。
在亚健康个体中使用NKM细胞疗法的潜在免疫正常化
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来源：参考资料1
经过治疗后，所有的4名亚健康人的表达PD-1的CD8+T细胞的比例下降，3名亚健康人的表达PD-1的CD4+T细胞的比例下降。然后，作者得出结论是经过NKM治疗后，亚健康人的免疫功能恢复正常了。
「疑问7」：就区区4名志愿者，都没法做统计分析，就敢下NKM让免疫功能正常化的结论。这是天真还是无知？亚健康人群的定义缺乏科学证据，随意性很强。
小结和点评
毕竟这篇文章经过“评审专家“的评审和同意发表，所以不能简单地说这篇文章在胡说八道。文章题目已经点题，是利用NKM来让亚健康人群恢复免疫正常（免疫正常化），但是文章中只入组4名亚健康人，反而入组治疗了11名肿瘤患者。在文章中的讨论部分，作者提到NKM能让亚健康和肿瘤患者的免疫功能恢复正常。你信吗？
更有意思的是，文章中作者自己的数据证明自己培养的混合免疫细胞（即作者定义的NKM细胞）的杀伤力不如NK（包括NK92和从NKM分离出来的NK），只是比PBMC强，却还在通篇描述NKM的临床治疗。反正我是看不懂的。
参考资料
[1]Immune normalization strategy against suboptimal health status: safe and efficacious therapy using mixed-natural killer cells
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