治疗性外泌体的研究进展
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整理｜摩西
编辑｜南风
外泌体是一种活细胞分泌的囊性小泡, 携带大量具有组织或细胞特异性的蛋白质、脂质及遗传物质, 可调 控不同的生理活动, 因此作为一类新兴的治疗药物被广泛研究。
间充质干细胞 (mesenchymal stem cells, MSCs) 和 树突状细胞 (dendritic cells, DCs) 衍生的外泌体是研究较为广泛的两类外泌体, 已有许多临床前及临床研究表明其 在肺部疾病、肝脏疾病、神经系统疾病及肿瘤等疾病中展现出良好的治疗效果。
另外, 巨噬细胞、肿瘤细胞和植物细胞等众多其他细胞衍生的外泌体也因其治疗潜力受到越来越多的关注。除了天然来源的外泌体, 工程化外泌体的研究也取得许多进展。已报道的外泌体工程化手段种类繁多, 如外泌体靶向修饰、外泌体包载活性成分等。
本文总结了不同来源的治疗性外泌体的研究进展, 并讨论了外泌体的应用前景与未来可能遇到的挑战。
由细胞所分泌的细胞外囊泡可根据其大小、内容 物和形成机制差异分为凋亡小体、微泡、外泌体[1] 。凋亡小体和微泡从质膜中直接出芽产生, 而外泌体是起源 于细胞胞内体的纳米级脂质双层囊泡, 大小约为 30～ 150 nm, 形似杯状。外泌体最先于体外培养的绵羊网 织红细胞的上清液中被发现[2] , 但最初仅被视为细胞 清除不必要蛋白质的外排方式。后来研究证实, 外泌体是生物信息交流的重要媒介, 几乎所有细胞在不同 的生理和病理状态下均会分泌这一物质。外泌体表面富含胆固醇、神经鞘磷脂和神经酰胺等脂类物质, 内载蛋白质、核酸等生物信息, 另外还含有代谢产物和氨基酸等多种物质。外泌体根据是否经过人工修饰分为天然外泌体和工程化外泌体, 前者可分为动物源性外泌体和植物源性外泌体, 而动物源性外泌体又可细分为正常外泌体和肿瘤外泌体[3] 。因此, 目前外泌体的来 源是其主要的分类依据, 但未来可能会考虑从生物学分布、免疫原性等方面进行分类[4] 。外泌体的形成机制至今仍未明确, 目前主流观点 认为细胞质膜内陷首先形成内体 (endosome), 继而内 体向腔内出芽形成腔内囊泡转化为多泡体 (multive‐ sicular bodies, MVB), MVB 与质膜融合释放出的内部 囊泡即为外泌体[5] 。作为天然携带和传递细胞间信息 的载体, 外泌体保留了母体细胞的部分生物学功能, 可调节复杂的生物活动, 在多种疾病中显示出巨大的治疗价值。同时, 因其具有免疫原性低、尺寸小、具有高渗透长滞留效应 (enhanced permeability and retention, EPR) 等优势, 被广泛应用于药物递送, 如小分子化学药物、蛋白质和核酸等[6] 。本文围绕治疗性外泌体, 就 外泌体的细胞来源、外泌体工程化、临床应用及其前景 和挑战展开重点介绍 (图1)。
外泌体的来源、分离、工程和应用。MSC:间充质干细胞；DC ：树突状细胞
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外泌体的分离技术
由于外泌体的大小、来源、内容物和功能均具有异质性, 目前尚无标准的、普适的外泌体分离技术, 这些原因极大制约了外泌体功能性方面研究内容的深入开展。大多数的分离技术无法将外泌体与具有相似物理 特性的脂蛋白和非内体途径的细胞外囊泡完全分离[3] 。目前常用的分离方法有超速离心法、聚合物沉淀法、超滤法、尺寸排阻色谱法、免疫亲和色谱法等[7] 。超速离心法是目前使用最广泛的方法, 其原理是根据溶液中颗粒的物理性质、溶剂的密度和黏度依次将组分分离。其优点是无需试剂即可用于提取大体积的样本, 但是提取过程耗时较长且得率低。聚合物沉淀法 的原理是通过添加聚合物从而改变外泌体的溶解度和 分散性, 最终借助较低转速的离心方法得到外泌体。该方法操作简便、无需超速离心机、产率高, 然而易引入 沉淀试剂和脂蛋白等杂质, 可能会影响下游分析。超滤法和尺寸排阻色谱法是基于外泌体和其他囊泡之间存 在大小尺寸差异而实现分离的方法。超滤法快速、纯度中等, 但由于膜的吸附作用可能造成外泌体损失。尺寸排阻色谱分离的外泌体纯度高, 保留了完整性和生物活 性, 缺点是分离过程耗时长、不适合大规模生产、价格偏高。免疫亲和色谱法可分离高纯度的外泌体及外泌体 亚群, 但需要选择合适的标志物, 用于分离总外泌体时 可能由于不用亚群之间标志物的表达差异造成偏倚。总而言之, 外泌体的分离需要综合考虑样本体积、纯度、 成本、仪器、时间和研究目的等因素选择最合适的方法。
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间充质干细胞来源的外泌体治疗
间充质干细胞 (mesenchymal stem cells, MSCs) 是 再生医学领域中使用最广泛的干细胞, 离体增殖能力 强, 能够从多种组织中被分离得到, 如骨髓、脂肪、脐带 和胎盘等。免疫调节特性和高生产能力是MSCs所具 有的两个显著特征。初步数据表明, 间充质干细胞衍 生的外泌体 (MSC-derived exosomes, MSC-Exos) 也具 有MSCs 的一些免疫调节特性。同时, MSCs被认为是 产生外泌体能力最强的细胞[8] , 已越来越多地被应用 于临床治疗。自首次报道以来, MSC-Exos 可以作为 MSCs“无细胞”治疗剂, 能够有效增强药物诱导的肝损伤中的肝再生[9] 、促进皮肤伤口愈合[10] 、骨骼肌再生[11] 、 骨折愈合和软骨再生等[12] 。
间充质干细胞外泌体治疗肺部疾病
肺部慢性和急性疾病, 如慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化和肺动脉高压, 被认为是世界范围内的主要健康问题。MSCs的细胞疗法与无细胞疗法为慢性和急性肺部疾病提供了一种新的治疗方法, 该方法具有抗炎、免疫调节、再生、促血管生成和抗纤维化的特性。线粒 体功能障碍是吸烟引起肺部炎症和慢性阻塞性肺疾病 的机制之一[13] , 已有研究表明MSCs和MSC-Exos的联合治疗具有抗炎作用, 并且能够减少线粒体损伤反应 的发生, 在由香烟烟雾诱导的肺损伤小鼠模型中显示出治疗效果[14] 。支气管肺发育不良 (bronchopulmonary dysplasia, BPD) 是一种多因素慢性肺部疾病。基于MSC-Exos疗法的BPD临床前研究表明, MSC-Exos不仅可以预防 BPD, 还可逆转肺损伤[15] 。MSC-Exos 的作用机制与调节肺巨噬细胞的表型有关, 通过抑制巨噬细胞促炎M1态和增强抗炎M2态, 从而抑制肺部炎 症和免疫反应[16] 。在低氧诱导的肺部炎症反应的实验模型中, MSC-Exos 通过抑制信号传导与活化转录因子3 (signal transducers and activators of transcription, STAT3) 介导的信号传导发挥肺部保护作用并抑制肺 动脉高压[17] 。
另外, MSC-Exos 在急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征中同样发挥重要作用[18] 。2020年, 新型冠状病毒肺炎 (coronavirus disease 2019, COVID-19) 大流行 对全球公共卫生和国际经济产生了重大影响, 迫切需要一种有效的疗法来治疗COVID-19患者。目前已开展针对 COVID-19 的MSC及其外泌体治疗的安全性 和有效性的多项临床试验评估, 结果显示 MSC-Exos 治疗能够改善某些COVID-19患者的病情。其治疗作用在于减少细胞因子风暴, 增强肺泡液清除能力, 并促 进上皮和内皮的恢复[19] 。因此, MSCs 及其外泌体有望成为新冠肺炎治疗候选药物。此外, 外泌体还可以作为生物标志物、疫苗和药物输送系统, 用于治疗 COVID-19患者[20-22] 。
间充质干细胞外泌体治疗肝脏疾病
MSC-Exos在许多损伤修复中起到重要作用, 最近的多项研究显示出其在肝病动物模型中的治疗作用。Tan等[9] 研究结果表明, MSC-Exos主要通过激活肝细胞增殖、上调Bcl-xL (B-cell lymphoma-extra large) 蛋白表达, 从而抑制肝细胞凋亡, 发挥在肝损伤的保护作用。Qu 等[23] 发现 miR-181-5p 修饰的脂肪间充质干细胞(miR-181-5p-modified adipose-derived mesenchymal stem cells, miR-181-5p-ADSCs) 衍生的外泌体具有抗肝纤维化的作用。研究者将ADSCs经过工程改造以表达 miRNA-181-5p, 并通过外泌体将 miRNA-181-5p 递送至小鼠肝星状细胞 (mouse hepatic stellate cells, HSTT6) 或 CCl4诱导的纤维化肝脏。结果表明, 来自 miR181-5p-ADSCs的外泌体通过下调STAT3和Bcl-2表达 并激活 HST-T6 细胞的自噬, 防止肝纤维化的发生。Liu 等[24] 研究脂肪组织来源的间充质干细胞衍生的 外 泌 体 (exosomes from adipose tissue-derived MSCs, AMSC-Exos) 对急性肝衰竭 (acute liver failure, ALF) 治 疗 的 作 用 及 其 机制。结果表明, miR-17 修饰的 AMSC-Exos可通过减少巨噬细胞中的NLRP3炎性小体 活化来改善脂多糖和 D-半乳糖胺 (lipopolysaccharide and D-galactosamine, LPS/GalN) 诱导的ALF, 而miR-17 敲除的AMSC-Exos则显示明显减弱的ALF的治疗作用。这项研究为MSC-Exos疗法及其潜在机制提供了新的见 解, AMSC-Exos可能是预防暴发性肝炎及其他TXNIP/ NLRP3炎性小体增加的相关炎性肝病的新型策略。
间充质干细胞外泌体治疗神经系统疾病
外泌体在神经系统疾病的治疗和损伤修复中也有巨大的潜能。虽然MSCs不能通过分化为神经细胞和替代神经细胞来实现其再生作用, 但是 MSCs 衍生的外泌体能够携带修复脑损伤的物质。Chen等[25] 研究表明, EP4 (E-type prostanoid receptor 4) 拮抗剂可诱导 MSCs 外泌体中 2',3'-环核苷酸 3'-磷酸二酯酶 (CNP) 上调, 进而促进受损大脑中神经元和神经突触形成, 以及记忆、认知和学习功能的恢复。近年来, 外泌体作为脑卒中的治疗手段也经历了迅速的发展。以MSCs为基础的治疗手段能够在脑卒中的亚急性期促进大脑功能恢复, MSC-Exos 是介导其组织修复作用的关键[26] 。MSC-Exos具有治疗脑卒中的功效, 同时, 外泌体可能是反映疾病病理进展的生物标志物[27] 。在体外 , miR-17-92 能够促进少突胶质细胞生成、神经发生和 轴突生长。Xin 等[28] 研究表明, 用富含 miR-17-92 的 MSC-Exos治疗脑卒中可以增强脑卒中后神经可塑性 并促进神经功能恢复。另外, 富含 miR-133b 的 MSCExos 也能够促进大鼠脑卒中后的神经重构和功能恢 复[29] 。在实验性脑出血与脑缺血动物模型中, 接受外 泌体治疗的动物在病变大小、白质修复和功能恢复等方面显示出更好的结果[30,31] 。
间充质干细胞外泌体的其他治疗作用
MSC-Exos 还有许多其他的治疗作用, 如促进皮 肤伤口愈合、软组织修复和缺血心肌修复, 抑制疤痕形 成、干预肿瘤的发生发展过程等。皮肤修复和再生是动态而复杂的过程, 外泌体在 皮肤伤口愈合中发挥重要作用[32,33] 。Hu 等[34] 发现表明, AMSC-Exos可以通过优化成纤维细胞的特性促进 皮肤伤口愈合, 在伤口愈合的早期, 外泌体能够增加胶原蛋白I和III的产生, 而在后期, 外泌体可能通过抑制 胶原蛋白的表达以减少疤痕的形成。此外, 调节巨噬细胞 M2 极化与转运 microRNA 可能是加快皮肤损伤愈合的另外途径。
在体外和体内进行MSC-Exos治疗时也观察到其 具有心脏保护作用, 心肌细胞中 EZH2 的抑制或 miR25-3p 的过度表达是其可能的机制[35] 。在与心肌梗塞 (MI) 治疗剂的共同作用下, MSC-Exos 能够发挥促进 血管生成和免疫调节作用, 从而保护心脏并诱导随后的心脏再生过程[36] 。在骨相关疾病损伤中, MSC-Exos 通过增强细胞 增殖和浸润, 减少细胞凋亡和调节免疫反应来介导软 骨修复[37] 。一系列体内研究结果表明, 给予MSC-Exos有效地减少了软骨细胞中炎性细胞因子的产生, 增加了软骨细胞外基质成分的表达, 并最终增强了软骨组织的再生[38] 。MSC-Exos 的治疗作用是通过多种细胞的协调动员和功能激活来实现的。
另外, 已有研究表明 MSC-Exos 在肿瘤发生发展 过程中发挥“双刃剑”的作用, 即 MSC-Exos 对肿瘤细胞有着促进或抑制作用。人脐带间充质干细胞来源的外泌体通过转移MMP-2酶、改变细胞功能和重塑肿瘤 微环境来促进卵巢癌和乳腺癌细胞的增殖[39] 。源自胃 癌组织的MSC-Exos, 在体内外均能促进胃癌肿瘤细胞 的生长和迁移[40] 。来自胎盘的 MSC-Exos能够促进胎盘微血管内皮细胞迁移和血管生成[41] 。另外的研究表明经紫杉醇修饰的 MSC-Exos在胰腺腺癌中能够发挥 强大的抗肿瘤效果[42] , 经miR-143修饰的MSC-Exos能 够减少骨肉瘤细胞的迁移[43] , 经miR-122修饰的AMSCExos能够增加肝肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[44] 。
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工程化外泌体应用于疾病治疗
除了天然来源的外泌体, 近年来, 越来越多的研究 表明工程化外泌体在疾病治疗中具有巨大的潜力。目前, 已报道的外泌体工程化手段包括外泌体靶向修饰 和外泌体包载活性成分等。。。。。。
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