最新综述｜兰州大学第一临床医学院：干细胞治疗肝纤维化/肝硬化的临床进展和前景

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撰文｜摩西

编辑｜南风

本文节选自《Stem cells for treatment of liver fibrosis/cirrhosis: clinical progress and therapeutic potential》

每年全球约 200 万人死于肝病，占死亡总数的3.5%，其中100 万人死于肝硬化并发症_[1]。肝硬化是全球第11位最常见的死亡原因，未来全球死于该原因的人数和比例将继续增加（2017年肝硬化死亡人数超过132万人，但1990年死亡人数不到899,000 _[2] ）。

慢性肝病一般按严重程度分为四个阶段：（1）炎症；(2)肝纤维化；(3)肝硬化；(4)终末期肝病 (ESLD) 或肝癌 _[3]。这是一个连续的过程，其中晚期肝硬化或 ESLD 的肝功能不可逆地受损；唯一的治疗方法是肝移植，但该方法又受限于免疫排斥反应、术后不良并发症、器官短缺等因素。

1976 年，第一个临床前原代人肝细胞（PHHs）移植阐明了细胞疗法的前景 _[4]。此后，慢性肝病的细胞疗法发展迅速。PHHs 被认为是治疗代谢性肝病的理想来源，并已投入临床应用 _[5]。然而，PHHs 很难在体外扩增，且来源非常有限。

目前，干细胞在I期和II期临床试验中对治疗肝纤维化和肝硬化有效的证据引起了广泛关注。由于人类原代干细胞提取和应用的伦理问题，使用干细胞治疗肝纤维化和肝硬化的临床试验数量有限。在过去的几十年中，干细胞疗法在动物模型中的有效性、可行性和安全性已得到广泛报道。动物模型架起了干细胞从基础研究到临床应用的桥梁。_[6,7]

与传统治疗方案相比，干细胞疗法对患者的侵入性低于手术方法，并且免疫排斥的风险较低。在本篇综述中，研究者总结了使用干细胞治疗肝纤维化和肝硬化领域的最新临床进展。

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干细胞治疗肝硬化/纤维化的临床进展

在clinicaltrials.gov网站上以“肝病”和“干细胞”等其他术语进行搜索时，共有160个使用干细胞治疗肝病的临床试验，包括终末期肝病、肝癌、肝纤维化和肝硬化，其中75项试验（47%）侧重于肝硬化或肝纤维化（不包括已终止和撤回的试验）。在这75项研究中，大多数试验集中在 I/II 期（36%）（图1A）。

图1:干细胞治疗肝纤维化或肝硬化的相关注册临床试验分类。A按临床阶段分类的临床试验；B目前临床试验中应用的不同干细胞；C按递送途径分类的临床试验。

对于细胞疗法，以下三点是特别值得关注的：细胞类型、细胞数量和给药途径。

用于治疗肝纤维化或肝硬化的细胞来源多种多样，最广泛使用的是间充质干细胞 (MSCs) (73%) (图1B )。目前应用于临床试验的间充质干细胞来自不同组织，如骨髓、脐带、脂肪、经血、牙髓和肝脏。

在之前的一项研究中发现，静脉回输MSCs 大部分被肺截留_[14]。鉴于此，MSC 需要多次输注方能达到理想的疗效。而细胞剂量取决于患者体重、临床情况、给药途径和细胞类型。在肝硬化或肝衰竭中，肝细胞移植旨在为受损肿块提供功能性实质支持，从而促进肝脏的修复。基于这一概念，单次回输的细胞计数约为理论肝脏质量的10-15%，高于肝脏代谢紊乱 _[15]。注射的最大细胞量不超过肝实质的5%（约1×10¹¹个肝细胞）。细胞输注的并发症，如门静脉高压症和细胞栓塞，限制了可以输注的细胞数量 _[16]。

肝细胞移植不仅效率低下，而且需要抑制患者的免疫系统。局部而非全身给药 MSCs 可改善部分肝切除术后的肝纤维化_[17]。在肝纤维化和肝硬化的管理中，MSCs 的剂量普遍低于肝细胞，这反映了 MSCs 的主要作用机制不是通过替代细胞，而是促进内源性肝由分泌的生物活性分子介导的再生和免疫调节。在安全和最低有效给药剂量范围内，低、中、高剂量组的结果似乎没有差异 _[18]。间隔和重复注射（例如每周两次）的治疗效果似乎更稳定和显着；但是，单次充分剂量的注射方案是保障疗效的基础_[19]。

细胞治疗途径目前分为两类：干细胞悬液输注或干细胞生物工程改造物移植。

通过肝动脉给药（32%）是大多数临床试验的首选（图1 C）。这可能是因为通过肝动脉输注的干细胞比静脉输注具有更好的定植能力 _[20]。值得注意的是，在这些临床试验中，只有一项使用了生物工程产品，即与 hUCMSCs 结合的可注射胶原支架 (NCT02786017)。

除了临床试验的细节，细胞疗法的安全性和有效性是最关键的。干细胞在治疗肝硬化或肝纤维化的临床试验中取得了显著的进展。用于评估干细胞效率的常用指标是血清 ALB 水平、血清胆红素、Child-Pugh 评分和 MELD 评分。安全性评估主要根据术后不良并发症，如发热、过敏反应、咳嗽、胸闷和呼吸困难等。虽然这些临床试验看起来更安全，但仍然需要更大规模的研究。使用干细胞治疗肝纤维化或肝硬化的代表性临床试验见下表。

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用于肝纤维化/肝硬化治疗的干细胞类型

从上述临床试验中不难看出，已有多种细胞类型用于肝纤维化和肝硬化的管理，以下是所提到的细胞类型的详细描述（图2）。

用于治疗肝纤维化/肝硬化的候选干细胞类型

间充质干细胞

间充质干细胞是应用最广泛的干细胞类型，可以从成人或围产期组织中获得，包括骨髓、脐带、脂肪组织、肝脏、牙齿、经血、尿液_[21]和胎盘_[22] 中提取。

MSC 具有相同的特征（CD73、CD90 和 CD105 阳性，CD34、CD14 或 CD11b、CD79 或 CD19、HLA-DR 阴性）_[23]。

• 脐带间充质干细胞

UCMSCs 可以从华通氏胶和脐带血中获得，UCMSCs通常通过酶消化法和外植体法获取，并按照良好的生产规范 (GMP) _[24]制备。

hUCMSCs 通过分泌肝细胞生长因子 (HGF) 和增加硫代乙酰胺损伤小鼠肝脏中增殖细胞核抗原 (PCNA) 和 Est-1 p42 蛋白的表达来促进肝脏修复和改善微环境 _[25]。此外，hUCMSCs 在肝病小鼠模型中也表现出优异的免疫抑制能力和高Treg促进作用 _[26]。此外，hUCMSCs 移植通过上调 microRNA-455-3p 介导 p21 活化激酶 2 (PAK2) 沉默来抑制肝星状细胞的活化_[27]。

• 骨髓间充质干细胞

BMMSCs 是从骨髓单个核细胞 (BMMNCs) 中分离出来的。将BMMNCs接种在培养瓶中，然后去除非贴壁细胞，从而形成定植的BMMSCs _[28]。

由于抗凋亡白细胞介素 (IL)-6、胰岛素样生长因子结合蛋白-2 (IGFBP-2) 和抗炎性 IL-1受体拮抗剂 (IL-1Ra)，植入受损组织的微囊化 BMMSCs 具有保护作用细胞因子被释放 _[29]。此外，肝脏特异性ECM诱导BMMSCs转分化为肝谱系，并通过替代肝实质细胞来逆转肝纤维化_[30]。

• 脂肪来源的间充质干细胞

脂肪来源的间充质干细胞 (ADMSCs) 可以从吸脂物或皮下脂肪碎片中获得并在体外扩增。用胶原酶消化脂肪组织，收集所得分散细胞并在烧瓶中培养_[31]。

ADMSCs 治疗脂肪性肝炎诱导的肝硬化后，炎症浸润的 CD11b⁺细胞、Gr-1⁺细胞的数量和 CD8⁺ /CD4⁺的比例降低 _[32]。目前，ADMSCs 和 BMMSCs 被认为通过类似的机制缓解纤维化 _[33]。

• 肝源性间充质干细胞

简而言之，从肝脏碎片中分离出单个核细胞并在体外培养以获得肝源性间充质干细胞（LDMSCs）。实验室已成功分离出人肝源性间充质样干细胞，这些干细胞高度表达 GATA4 和 FOXA1 等内胚层标志物。LDMSCs 对 CD29、CD73、CD44、CD90、CD105 和 CD166 以及白蛋白、甲胎蛋白、细胞角蛋白8和细胞角蛋白18这些肝脏标志物呈阳性 _[34]。LDMSCs 既表达了MSC的一些表面标志物，又具有肝细胞的一些功能_[35]。

在硫代乙酰胺诱导的肝损伤免疫缺陷 NRG 小鼠模型中，与 hUCMSCs 相比，hLDMSCs 在受损肝脏中移植的速度更快，分化为成熟的肝细胞 _[36]。此外，与 BMMSCs 相比，LDMSCs 分泌更高水平的促血管生成、抗炎和抗凋亡细胞因子_[34]。

• 经血来源的间充质干细胞

经血来源的间充质干细胞 (MenSCs) 是通过密度梯度离心法从离心的人经血中分离出来的，它们表达MSC标志物，但不表达 HLA-DR、CD34、CD45、CD117。有趣的是，其他来源的MSCs中不存在阶段特异性胚胎抗原4 (SSEA4)，但 MenSCs 中 SSEA4 的表达存在争议 _[37,38]。

MenSCs 显着降低肝组织中 α-平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) 和转化生长因子-β1 (TGF-β1) 的表达，并通过旁分泌介质如单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)抑制活化的肝星状细胞、IL-6、HGF等，进一步降低了四氯化碳诱导的肝纤维化中的胶原蛋白含量_[39]。

• 来自人类脱落的乳牙干细胞

来自人类脱落的乳牙 (SHED) 的干细胞是从健康的儿科捐赠者脱落的乳牙的残余牙髓组织中分离出来的。不同分离方法获得的 SHED 的性能存在差异 _[40]。它们具有 MSC 特征，包括细胞表面抗原表达和三系分化潜能。

移植的SHED能够在体内产生肝细胞样细胞，在肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的刺激下，SHED-Heps显示出胆管生成潜力_[41]。此外，SHED下调受损肝脏中与ECM分辨率相关的介质，通过防止炎症浸润促进肝纤维化的恢复 _[43]。

造血干细胞

HSC 是在骨髓和血液中发现的原始细胞。HSC 是从接受粒细胞集落刺激因子 (G-CSF) 皮下注射或通过流式分选系统从骨髓分选的患者中提取的外周血单个核细胞中纯化的。此外，HSC也可以从脐带血中获得。因此，HSC 对 CD34、CD45 和 CD133 呈阳性 _[44]。

最近的随机临床试验表明，无论是否与 HSCs 联合，G-CSF 都不能改善代偿期肝硬化患者的 MELD 评分，这可能是由于 G-CSF 的不良反应 _[44]。与 BMMSC 相比，HSC 在肝损伤中的抗炎和抗氧化作用可以忽略不计 _[47]。HSC 对肝脏修复的贡献主要是通过释放刺激内源性肝细胞再生和促进肝内血管生成的旁分泌因子 _[48]。HSC 移植或 HSC 与其他干细胞共同移植已被证明在难治性腹水伴肝纤维化 _[49] 或胞质分裂8蛋白缺乏症患者 _[50]中是可行的。

骨髓单个核细胞

BMMNCs 是从骨髓中分离出来的，该骨髓是在局部麻醉下通过密度梯度离心从患者的髂后嵴抽吸出来的。BMMNCs 是由多个干细胞/祖细胞组成的细胞群。BMMNCs 的制造商包括三种类型：内皮谱系标志物，如 CD31 和血管内皮生长因子受体 (VEGFR)、BMMSC 表面标志物和 HSC 标志物 _[51]。

骨髓来源的 CD11b + CD14 +单核细胞通过减少氧化应激和炎症来改善肝纤维化，单核细胞治疗的小鼠具有更高水平的谷胱甘肽 (GSH)，这代表了抗氧化能力。此外，单核细胞治疗组表现出促炎性 TNF-α 和 IL-6 下调和抗炎性 IL-10 上调 _[52]。除此之外，BMMNCs 的丙二醛和标准化总抗氧化能力 (TAC)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GPx)、过氧化氢酶 (CAT) 和超氧化物歧化酶 (SOD) 均显着下降 _[53]。

内皮祖细胞

内皮祖细胞 (EPC) 从各种组织中获得，在临床实践中最常被称为 BMMNC。在由细胞因子血管内皮生长因子 (VEGF)、胰岛素样因子-1 (IGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) 和表皮生长因子 (EGF) 组成的内皮完全培养基下诱导 BMMNCs。

EPCs 移植通过在四氯化碳诱导的肝纤维化中分泌更高的 MMP-2 和 VEGF 来激活 HGF 介导的肝细胞增殖并增加肝窦血管密度 _[55]。

肝细胞

肝干细胞的定义仍然存在争议，因为在某些情况下，肝细胞和胆管上皮细胞可以被视为各自的特定干细胞_[57]。目前用于临床试验的肝细胞是成人或胎儿肝细胞。通过胶原酶灌注技术收集肝细胞 _[58]。新鲜肝细胞的存活率应超过60%，并且由于肝细胞的特殊特性，分离的肝细胞应立即移植或冷冻保存 _[16]。

在肝硬化或肝衰竭中，肝细胞移植旨在为受损肿块提供功能性实质支持，为肝脏的恢复提供可能 _[15]。事实上，肝细胞移植不仅效率低下，而且还需要抑制患者的免疫系统。移植 3-5% 的肝脏质量仅导致0.5%的宿主肝脏移植，移植细胞丢失是由于患者的CD8⁺T 淋巴细胞针对供体 HLA 抗原的同种异体反应 _[59]。

引人注目的是，肝祖细胞（LPCs）是一类可以进一步分化为肝细胞和胆管上皮细胞的双能干细胞。它们被认为在长期肝损伤中起关键作用 _[60]。最近的研究表明，肝细胞和胆管上皮细胞之间可以相互转分化以促进肝脏修复，而不会经历慢性肝损伤过程中肝祖细胞的状态_[61,62]。

肝细胞样细胞

各种干细胞已显示出体内肝分化的潜力，因此肝细胞样细胞 (HLC) 也已在临床上用于治疗肝纤维化或肝硬化疾病。

有研究者分别比较了MSCs治疗组和HLCs治疗组的疗效；两组的肝功能均有所改善，但 MSCs 在某些参数上表现出更好的结果 _[69,70]。在一项研究中显示，诱导多能干细胞 (iPSCs) 比未分化的 iPSCs 更有效。用每公斤体重4.0×10⁷个iPSCs 衍生的肝细胞治疗显着减轻了小鼠的严重肝功能衰竭；然而，等效剂量的iPSC没有显着的治疗效果 _[72]。这表明胚胎干细胞（ESCs）或iPSCs需要先分化才能产生很好的治疗效果。

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干细胞治疗肝纤维化的机制

肝纤维化的发展是伤口愈合的过程，涉及肝细胞死亡、免疫细胞浸润、肝损伤、肌成纤维细胞活化和细胞外基质过度沉积等关键事件（图 3）。

图3:干细胞治疗肝纤维化的机制

干细胞治疗是通过：肝再生、免疫调节、抗肝损伤、抑制肌成纤维细胞活性、细胞外基质降解和重塑这五个机制来发挥治疗作用的。

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各种干细胞的潜在优势和局限性

干细胞来源比较及优缺点

虽然目前临床使用的UCMSCs（人脐带间充质干细胞）是同种异体的，但围产期 MSCs 高表达 HLA-G，这对于妊娠期间母体免疫系统的适应以及对所有免疫细胞的抑制作用至关重要，使 UCMSCs 具有先天的免疫豁免权 _[73] 。UCMSCs在P3代时表现出最强的增殖能力，然后随着体外传代次数的增加而缓慢减弱 _[74]。UCMSCs 特征性地表达与包括 NPY 在内的神经元发育相关的转录组，这意味着 UCMSCs 更优先分化成神经细胞并在神经系统疾病中具有应用前景 _[75]。制备成本低、体外大规模扩增的便利性以及不存在伦理问题使 UCMSCs 成为临床使用的最有希望的细胞来源。

与 UCMSCs 相比，BMMSCs（人骨髓间充质干细胞） 具有优越的中胚层分化能力，包括成骨或软骨形成和脂肪形成能力。一组与抗菌活性相关的基因在 BMMSCs 中表达较多，而与基质重塑相关的基因在 UCMSCs 中表达较多 _[76]。BMMSCs具有很强的分化潜能，但人BMMSCs是通过侵入方式获得的，获取数量有限，这阻碍了BMMSCs在临床应用中的进一步发展。

由于 ADMSCs（人脂肪间充质干细胞） 对高氧诱导的细胞凋亡和氧化应激诱导的衰老具有更强的抵抗力，此外，其优越的促血管生成能力和端粒酶的高活性，使ADMSCs 在再生能力方面比 BMMSCs 更具优势 _[77]。ADMSCs和BMMSCs在免疫表型上没有显着差异。ADMSCs 的另一个最明显的优点是它们更高的分离成功率和增殖率 _[78]。ADMSCs 采集简单，可广泛获得，细胞活力不受供体年龄的限制，因此在再生医学中具有广泛的应用范围。

LDMSCs（肝源性间充质干细胞） 更接近肝脏本身的环境，特别是当它们表达内胚层相关标志物时，但正常胎儿肝脏的来源有限。LDMSCs 目前在临床试验中并不普遍。

与 BMMSCs 相比，没有诱导刺激的 MenSCs（经血来源的间充质干细胞）能够在没有染色体异常的情况下扩增至18代 _[37]。与 BMMSCs 相比，MenSCs 的增殖能力高2-4倍_[79]。然而，令人担忧的是，很少有临床试验使用 MenSCs 治疗肝病，标准分离方案和培养条件是关键问题。安全性和有效性尚未得到充分验证。

SHED 在神经源性方面比 BMMSCs 更有效 _[80]。SHED 是可访问的、易于隔离的和低侵入性的，但缺乏对这些特征和功效的严格澄清将阻碍它们的前景。

HSC移植首先应用于血液病领域。考虑到临床应用 _[81] ，保持 HSC 的自我更新和未分化状态以进行离体扩增是目前的一项严峻挑战。符合临床管理标准的 HSC 短缺和低免疫原性 HLA 匹配的 HSC 来源有限 _[82]。鉴于制备自体 HSC 的复杂性和高成本以及细胞数量的限制，HSC 更适合伴有血液学障碍的再生障碍患者。

由于BMMNCs中包含的细胞类型丰富，BMMNCs具有异质性。BMMNC 越来越多地用于临床试验，没有进一步细分。BMMSCs 移植改善了肢体缺血和增加血流量，但 BMMNCs 没有显着效果 _[83]。然而，由于BMMNCs的成分复杂，其临床应用仍存在歧义。

EPCs（人乳牙干细胞） 在临床治疗中的关键限制是数量少。EPCs需要人工诱导体外生长，EPCs的异质性和制备工艺的不规范性，阻碍了其在临床上的发展。

肝实质细胞是治疗肝病最理想的细胞来源，但PHHs衍生疗法在临床应用中遇到了诸多挑战，如PHHs在传统培养条件下增殖能力有限、失去原有表型等 _[71]。

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小结

本综述的研究者从临床进展、临床阶段和干细胞给药的角度总结了目前可用于肝硬化和肝纤维化临床试验的干细胞来源。客观地讨论了各类干细胞在临床应用中的局限性和前景。希望通过本文，读者能理性客观的认识干细胞治疗肝纤维化/肝硬化的临床价值。

参考资料：

Liu, P., Mao, Y., Xie, Y. et al. Stem cells for treatment of liver fibrosis/cirrhosis: clinical progress and therapeutic potential. Stem Cell Res Ther 13, 356 (2022). https://doi.org/10.1186/s13287-022-03041-5

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