MSC外囊泡与生物材料结合：皮肤伤口愈合的新治疗策略
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撰文｜摩西
编辑｜南风
声明｜本文仅作为公益科普，拒绝商业用途的转载，亦不构成任何建议。
前言 /
皮肤是人体最大且可以说是最重要的器官，占体重的16%。它可以防止外部侵害，例如紫外线辐射、磨损和寄生虫，并防止脱水。因此，皮肤的完整性对于生存至关重要。在可能影响皮肤的病症中，有外伤或损伤造成的伤口。某些情况下，伤口愈合的过程会减慢并变成慢性，导致难以愈合或慢性伤口。
目录：
皮肤伤口愈合的生理学和病理学
MSC与伤口愈合的临床研究
MSC 衍生的细胞外囊泡
MSC-EV 参与伤口愈合的机制
细胞外囊泡药代动力学
结论和未来展望
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导致皮肤伤口发生难以愈合的情况的主要风险包括：衰老、糖尿病和顽固性感染。此外，愈合后期的过度纤维化会产生增生性疤痕，在更极端的条件下会退化为瘢痕疙瘩。
难以治愈的皮肤溃疡数量正在增加，主要发生在经济最发达国家。一定程度上是由于人口老龄化和糖尿病等疾病患病率增加所致。皮肤溃疡数量的增加，自2017年以来增加了48%。据估计，到2045年，全球将有6.29 亿人会发生相关问题。
尽管皮肤移植等常规治疗降低了患者的死亡率，但可供移植的组织来源仍然受限。此外，许多患者并不满意当下的治疗结果，例如手术切除、换药、高压氧治疗和负压伤口治疗。近年来出现的治疗此类溃疡的新疗法中，有通过在体外扩增间充质干细胞（MSC）并将它们接种到受损组织中以促进愈合，这要归功于这些细胞的再生能力。
MSCs并不会通过直接分化成不同细胞类型来发挥再生能力，而是与其旁分泌作用机制相关。多项研究表明，来自MSC培养物的条件培养基具有再生能力，与MSC的再生能力相似，甚至更优。因此，MSC分泌蛋白组可能在MSC的治疗能力中发挥非常重要的作用。
MSC 衍生的细胞外囊泡具有免疫调节特性，这使它们具有很高的诱导再生过程的能力。在皮肤溃疡中，能够促进细胞的增殖、迁移和血管形成。然而，这些囊泡在受损组织中的半衰期可能很短。因此，将细胞外囊泡（EV）直接应用于伤口的治疗可能不是很有效。
皮肤伤口愈合的生理学和病理学
近年来，许多注意力集中在MSC 衍生的 EV与生物相容性材料的组合上，以保持其生物活性，进一步控制它们释放到伤口区域。生物材料为愈合提供适当的微环境，可以提高细胞外囊泡的生物学效应，对伤口愈合的速度和质量产生积极影响。
在皮肤中，组织损伤是通过复杂的生物过程修复的，涉及各种细胞类型、生长因子和细胞因子的广泛结合。作为防止非生物外部因素破坏作用的保护屏障，以及防止身体脱水和保护伤口来自生物侵略（感染），恢复皮肤所有层（表皮、真皮和皮下组织）的完整性对其功能至关重要。
正常疤痕会在缓慢的愈合过程中形成疏松的纤维结缔组织，是一个动态的过程，包括：止血、炎症、增殖和成熟/重塑四个阶段。这些阶段可能会重叠，甚至伤口的不同区域可能处于不同的愈合阶段。在伤口形成后的几秒或几分钟内，止血开始于血小板的作用。后者产生止血的血凝块，进一步保护伤口区域免受微生物入侵。此外，形成的纤维蛋白网络作为血管细胞、白细胞和成纤维细胞迁移的平台。还释放激活后续愈合阶段所必需的不同细胞因子、激素和趋化因子。
在第二阶段，在溃疡区域引起炎症反应，目的是清洁皮肤受损区域。在伤口产生后的最初24小时内，中性粒细胞合成蛋白酶和抗菌化合物。它们会杀死在破坏皮肤屏障后被捕获的微生物。在受伤48小时后，受损区域被巨噬细胞和淋巴细胞清除，吞噬并消化基质和现有微生物的残留物。然后，它们改变表型，参与抗炎细胞因子和细胞外基质 (ECM) 的产生。48小时后，炎症过程关闭以防止病理过程的发展。
第三阶段包括再上皮化、新血管形成和肉芽组织形成，这发生在受伤后长达两到三周。由于角质细胞以及再生表皮干细胞的分化和增殖，会促使受损皮肤的再上皮化。它们起源于伤口边缘的毛囊间表皮、毛囊和皮脂腺。细胞因子和血管生长因子，如血管内皮生长因子 (VEGF) 和碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)，可诱导血管生成，从而形成新血管。这个过程对于伤口部位缺氧和营养缺乏时的愈合进展很重要。成纤维细胞也会增殖并产生大量的ECM成分。部分成纤维细胞在转化生长因子β（TGF-β）的作用下分化为肌成纤维细胞。它们具有收缩功能：通过整合素附着于细胞外基质，并通过α平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) 收缩。因此，伤口的尺寸减小，有助于其闭合。
最后，经过更长的成熟/重塑阶段（皮肤损伤后长达一年），组织达到其最终愈合外观。皮肤伤口闭合后，颞部伤口基质中纤维状胶原蛋白I与胶原蛋白III的比例 (2:1) 恢复到正常皮肤水平 (5:1)。此阶段的特点是整个无组织ECM的重组，以及真皮细胞结构和血管密度的减少。一般来说，浅表损伤后，肉眼几乎看不到（或什至看不到）疤痕。在较深的伤口的情况下，疤痕通常是可见的，但被视为光滑、苍白和扁平的区域，称为正常营养性疤痕。
由于这个最后阶段，表面损伤会产生几乎看不见的疤痕。在深部创伤中，它们通常看起来光滑、苍白且扁平。这些阶段的不正确顺序和时间可能会导致异常愈合。这种组织修复过程的失败可能与血管疾病、糖尿病或衰老有关，也可能是由负责此类过程的基因的遗传变异引起的。如果炎症期超过三周，可能会变成慢性溃疡。另一方面，增殖期纤维化过度可能会产生增生性瘢痕或瘢痕疙瘩（图1）。
图1.伤口愈合过程中的病理过程。与正常伤口愈合过程 ( a ) 相比，如果炎症阶段持续超过三周 ( b )，则可能会变成慢性溃疡。增殖期过度纤维化可能导致增生性疤痕或瘢痕疙瘩 ( c )。
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来源：参考资料[1]
炎症反应在伤口愈合过程中是必不可少的。然而，延长的急性炎症期可能会损害角质形成细胞的增殖和促纤维化巨噬细胞的募集。慢性炎症是糖尿病患者愈合不良的原因之一，是大多数非创伤性下肢截肢的原因。事实上，15–20%的糖尿病足溃疡可能面临需要截肢。糖尿病会降低免疫反应，加剧感染，它还会导致微循环缺陷，连同周围神经病变和周围动脉疾病，最终发生皮肤溃疡。
MSC与伤口愈合的临床研究
已经发表了多项关于MSC在不同疾病中的应用的临床研究。包括各种肿瘤、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症、急慢性心力衰竭、中风、克罗恩病、肾脏和肝脏慢性疾病、糖尿病、骨关节炎和类风湿性关节炎、骨坏死、腰椎间盘退变、脊髓挫伤、败血症和严重肢体缺血 。MSC 提供了显着的治疗潜力，因为它们可以在体外扩展，可以长时间冷冻保存并保持有效性，表达中等和低水平的MHC I类和II类分子，并且可以静脉内给药。
当受伤发生时，MSC可以引发抗炎反应，促进新血管形成以促进组织再生。MSC分泌的营养因子，起到了旁分泌的作用。这被称为分泌蛋白组，可以介导细胞间通讯、细胞分化、化学吸引、免疫调节、纤维化抑制和细胞凋亡，以及促血管生成因子的分泌。
在皮肤伤口的情况下，MSC的生理反应如下：TNF-α和IL-1β由中性粒细胞分泌，MSC浸润伤口以应对局部炎症。当MSC到达伤口时，它们会产生促炎细胞因子，如 CCL2、CCL3、CSF2、IL-6 和 IL-8、CCL2和CCL3，从而募集中性粒细胞和巨噬细胞。它们负责激活适应性免疫系统，并开始降解受损组织。此外，MSC 募集浆细胞样树突状细胞并限制活化 T细胞以及其他先天免疫细胞的数量，以介导向下一阶段的过渡。在增殖阶段，MSC分泌一些蛋白质和因子，促进血管生成和再上皮化（EGF、HGF、VEGF、ANGPT1、PDGF-B和FGF）。MSC可以促进常驻巨噬细胞从炎症 (M1) 表型转变为伤口愈合 (M2) 表型。最后，MSC 分泌基质金属蛋白酶，诱导基质沉积和金属蛋白酶的组织抑制剂。这样就避免了细胞外基质蛋白的沉积，从而防止了疤痕的产生，重塑受损组织。
MSC衍生的细胞外囊泡
近年来，人们对作为再生治疗工具的MSC衍生的细胞外囊泡 (MSC-EV) 的兴趣有所增加。已经研究了它们对涉及肾脏、肝脏、心血管系统、伤口愈合以及神经和神经退行性疾病等多种重要疾病的影响。
MSC-EV 具有以下优势：
(i) 由于它们不是活细胞和增殖细胞群，因此避免了与免疫相容性、致瘤性、栓塞形成和细胞传播感染传播相关的问题；
(ii) 可以评估剂量和效力，例如常规药剂；
(iii) MSC-EV是稳定的，可以长期储存，没有明显的功效损失；
(iv) 收集过程是非侵入性的，可以通过改变培养基获得不同的因素；
(v) MSC-EV可以在受控条件下使用特定细胞系进行大规模生产；
(vi) MSC-EV可以设计用于携带特定分子，并用某些表面蛋白标记，以到达靶细胞；
(vii) MSC-EV易于静脉循环，能够穿过脑屏障。
MSC-EV 参与伤口愈合的机制：
MSC-EV参与伤口愈合的其中的一些过程，例如炎症、细胞增殖的诱导、新组织的形成以及某些生物分子的成熟和转移。
1. 止血期
在受伤的情况下，第一阶段的重点是血管收缩和纤维蛋白凝块形成，从而防止和保护机体免于失血。MSC-EV 参与血液凝固，减少了这种过程的时间并增加了凝块的面积。
2. 炎症期
在这个阶段，伤口环境被中性粒细胞清除掉细胞和细菌。此外，巨噬细胞吞噬组织碎片并产生一些细胞因子和生长因子，从而增强炎症反应。MSC-EV 可能在促进免疫调节作用、产生合适的伤口愈合环境方面发挥重要作用（图2a）。
图2. 细胞外囊泡在伤口愈合过程中的作用。EV 可能携带 miRNA 和蛋白质，这些 miRNA 和蛋白质可以调节不同皮肤伤口愈合阶段的各种生理过程。( a ) 在炎症阶段，MSC-EV 促进抗炎过程，抑制细胞凋亡，诱导巨噬细胞表型从促炎 (M1) 转变为抗炎 (M2) 并减少活性氧 (ROS) 的合成。( b ) 在增殖期，它们有助于新血管形成和再上皮化，刺激成纤维细胞迁移和增殖到伤口中。( c) 在重塑阶段，EV 增加胶原蛋白 I 的产生并促进无疤痕伤口愈合。括号中显示了与这些分子在不同伤口愈合阶段的功能相关的参考书目。
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来源：参考资料[1]
3. 增殖期
该阶段涉及成纤维细胞增殖、胶原蛋白 III 基质的产生和肉芽组织的产生。此时，血管生成极为重要。伤口环境需要新的血管来运输必要的营养物质、氧气和正确愈合的因素。有趣的是，MSC-EV参与内皮细胞增殖、迁移、生长因子分泌和血管形成。据描述，MSC-EV 可以将一些 miRNA 转移到内皮细胞并促进血管生成（图2b）。
4. 重塑期
在此阶段，胶原蛋白的过度表达可能会形成大疤痕。MSC-EV 可以增强皮肤的机械性能并减少疤痕形成，改善皮肤弹性和屏障完整性，增加一些皮肤屏障蛋白，如聚丝蛋白和兜甲蛋白，以及AQP3基因表达。此外，另一项研究表明，MSC-EV 可通过蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶 (ERK/MAPK) 信号通路增加 III 型胶原蛋白/I 型胶原蛋白比率，改善MMP3 表达，并调节成纤维细胞分化，以帮助无疤痕伤口愈合。在MSC-EV应用于伤口的抗纤维化作用中，已经观察到这些EV携带的不同 miRNA 的重要作用。因此，MSC-EV可以减少胶原蛋白沉积、成纤维细胞向肌成纤维细胞的转分化以及纤维化疤痕的形成。
细胞外囊泡药代动力学
如前所述，不同的研究表明MSC-EV参与各种生物过程。因此，由于它们是运输核酸、蛋白质和其他生物活性化合物的有效载体，因此 MSC-EV有望用于组织再生。要开发基于这些囊泡的疗法，重要的是要了解它们在体内应用时的药代动力学。
EV在静脉注射时主要分布在脾脏、肝脏、肺和胃肠道。值得注意的是，源自HEK293T人胚肾细胞的EV的组织分布因注射方法而异。静脉内应用时，它们主要储存在肝脏中。然而，通过皮下或腹膜内注射施用的囊泡在胰腺、肝脏和胃肠道中积累。
药代动力学研究要考虑的另一个方面是EV从血流中消除的时间和在器官中的蓄积时间。通过生物发光技术观察到，gLuc-LA标记的B16BL6 EV在静脉注射后的半衰期约为两分钟。此外，发现这些EV主要分布在肺、肝和脾中。据观察，来自不同小鼠细胞系的 EV 在静脉注射后的半衰期为2-4分钟，并在肝脏中积累。这些研究表明，尽管不管外泌体标记的方法如何，静脉内施用的EV会迅速从血液循环中消失，主要储存在肝脏中。
同样重要的是要确定哪些细胞类型识别和吸收EV，并结合它们的货物，以进一步推进基于EV的疗法的开发。不同的研究表明，主动吸收外源EV的原代细胞是巨噬细胞。因此，在没有巨噬细胞的小鼠中，静脉注射的 B16BL6 EV 从血液中清除的速度较慢，从而标志着这些细胞在外泌体药代动力学中的重要性。据观察，巨噬细胞负责肝脏和脾脏对 B16BL6 EV 的摄取，而在肺中，它们主要被内皮细胞摄取。
为了解决静脉内、皮下或腹腔内给药时EV的快速清除问题，囊泡与水凝胶等生物材料的组合已成为基于外泌体疗法的主要研究重点。EV 释放可以通过水凝胶特性（例如网络形态和交联密度）以及水凝胶可降解性来控制 。事实上，多项研究表明，将EV封装在水凝胶等生物材料中，可在水凝胶生物降解过程中持续释放EV。这提高了EV的生物活性的效率。在一项研究中，M2巨噬细胞衍生的 EV 被封装在可水解降解的聚乙二醇水凝胶中，用于皮肤伤口愈合。水凝胶的降解时间可在6-27天之间调节。从水凝胶中释放出来后，它们保留了它们的物理化学性质和生物学功能。
结论与展望
综上，将MSC-EV的应用与伤口敷料的使用相结合的策略的开发，具有维持稳定性和功能性的能力，有利于这些囊泡的逐渐释放，对治疗皮肤溃疡具有很高的治疗潜力。
总之，MSC-EV 与多功能伤口敷料的结合可能对皮肤伤口愈合产生积极的协同作用。目前的研究数据显示出巨大的临床应用潜力。在https://clinicaltrials.gov注册的临床试验中（截止2023 年1月25日），笔者发现有四项研究报告提出使用EV治疗皮肤溃疡：(i) NCT05475418（未开始招募），使用脂肪组织来源的外泌体；(ii) NCT05078385（未开始招募），使用BMMSC衍生的EV治疗烧伤；(iii) NCT04134676（已完成）。
为了更好地理解MSC-EV的分子作用机制、优化临床目的的工业生产以及方法学的标准化，还需要进一步的探索。同样，用于开发用于封装、保护和释放MSC-EV的合适的伤口敷料，增加生物材料和细胞外囊泡对伤口愈合的临床试验应该是未来几年的优先事项之一。这必定会让我们能够确定这种新治疗策略在常规临床实践中的潜在价值。
[1] https://doi.org/10.3390/app13042701
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