《Cell》：“癌症化身”——肿瘤类器官，指导精准用药的新工具

导语 / Introduction

癌症仍然是21世纪全球死亡的主要原因之一。尽管在确定肿瘤进展和耐药的分子机制以及靶向治疗方面取得了进展，但治愈癌症仍是一个艰难的挑战。随着细胞培养技术的发展，个体化3D肿瘤细胞培养物，能更好地模拟体内肿瘤的结构和功能。

在癌症的研究中有三个主要特点：(i) 了解癌症进展和耐药性的病理生理学特征；(ii) 抗癌治疗药物的体外筛选; (iii) 在体外再现患者肿瘤的特异性，以便进行个性化治疗方案的筛选。

球状体是由聚集成球形的单细胞形成的3D结构，用于研究细胞与细胞、以及细胞与基质的相互作用。球状体可以从多种细胞类型中产生，包括原代细胞、癌细胞系和癌症干细胞。而类器官是复制自然肿瘤结构和功能的更复杂的结构，由多种细胞类型组成，包括肿瘤微环境 (TME) 。

TME参与肿瘤血管生成和免疫逃逸，是肿瘤侵袭性和耐药性的关键因素。理想的3D肿瘤培养物不仅应保留原始肿瘤的分子特征，还应保留其特定TME的分子特征。包括免疫微环境在内的癌症类器官，可用于研究各种免疫疗法的效果，例如检查点抑制剂、癌症疫苗和嵌合抗原受体 (CAR)-T 细胞疗法。

每个癌症患者的TME都是特定的，因此，开发新技术使原始TME及其特定成分尽可能接近原始肿瘤是当前的首要挑战。在这篇综述中，小编将带读者一览目前可用的生成和培养肿瘤球体和类器官的解决方案、它们的优点和局限性以及最新进展。

体外培养肿瘤球状体和类器官

球状体和类器官可以从不同来源的细胞和组织中产生，包括原代细胞/活组织检查、癌症干细胞系和肿瘤细胞系 （图1）。由于每种都有其自身的优点和局限性，研究人员必须仔细考虑哪种来源和方法最适合特定的应用场景。

用于建立癌症球体和类器官的流程摘要

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来源：BioRender.com

来自肿瘤细胞系的球状体

从患者的肿瘤中分离出来的癌细胞系，可以在培养系统中无限增殖，从而生成大量用于实验目的的球状体。使用癌细胞系生成球状体的主要优点之一，是它们很容易获得并且可以购买（美国典型培养物保藏中心 (ATCC)）。

但癌细胞系仍不能达到个性化，并且在体内构成的癌细胞是异质的。此外，随着时间的推移，癌细胞系会发生遗传和表观遗传变化，这可能无法反映原始肿瘤细胞的特征，因此会影响从球状体模型获得的结果。 

来自原代细胞和患者活检的类器官

细胞系衍生球体的一种替代方法是从主要组织（例如患者衍生的活检组织）中生成类器官。这种3D结构被称为患者自体衍生的类器官(PDO)。乳腺癌、肺癌、胃肠癌、胃食管癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、肝癌、结直肠癌、视网膜母细胞瘤以及膀胱癌等多种癌症中都可产生PDO。

在实体瘤手术切除材料、穿刺活检或生物液体活检中获取患者的肿瘤样本，将其分成更小的块，然后在3D结构的条件下进行机械和/或酶解培养。

PDO可以更好地再现许多肿瘤的特征，包括原始宿主的特定遗传和分子多样性、缺氧、营养扩散和新陈代谢。但通常获得原代细胞需要外科手术的介入。在肺癌中，PDO 的生成平均只有40%的成功率。PDO 生成的失败与样本活检的质量以及收集技术有关。此外，生长的变化取决于活检的来源，这可能会影响所进行研究的结果。

PDO 的另一个局限性是起源肿瘤的空间异质性；活检可能无法完全捕捉肿瘤的复杂性和多样性，活检样本通常在特定时间点采集，可能无法反映患者体内发生的时间变化。并且样本可能未以标准化方式存储或处理，将会影响样本的质量和成分，并使数据难以比较。

来自转基因细胞的球状体和类器官

癌症起源于不同的遗传和表观遗传畸变。这种变异记录在癌症基因组图谱中，描述了超过 15,000种肿瘤。转基因细胞在模拟自组织3D环境中培养生成癌症类器官，可以让人们更深入地了解基因变化是如何促进癌症进展的，从而开发出新的靶向疗法。

同时，cluster regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) 技术革新了基因组编辑的范式，并适用于类器官领域。通过CRISPR/Cas9将癌症基因进行任意组合的改变后，引入正常类器官来构建癌症类器官模型，包括癌基因或抑癌基因 (TS) 的敲入 (KI) 或敲除 (KO)，以及基因抑制或激活。

不过，使用转基因细胞产生癌症类器官也有其局限性。基因改造过程本身会给类器官带来更多的不确定性，使研究得出的真实结论变得更加困难。

来自多能干细胞的癌症类器官

从胚胎干细胞或人类多能干细胞 (hPSC) 中产生癌症类器官，主要优势在于它们可以进行基因改造以模拟特定器官和疾病。包括癌症。如前所述，CRISPR/Cas9 技术也可用于引入人类肿瘤中发现的特定突变，然后可以将这些经过修饰的细胞分化成模拟相应肿瘤类型的细胞和分子特征的类器官。

来自多能干细胞的转基因类器官非常适合研究癌症的发展，以及对治疗的反应。脑肿瘤是全世界最致命和最具侵袭性的癌症之一。在2018年发表的一项研究中，Shan Bian 等人使用基因修饰的hPSC来产生脑癌类器官。该研究小组在第一个神经诱导步骤后通过转座子和 CRISPR/Cas9 介导，将突变引入细胞，所获得的类器官可用于探索肿瘤进展的潜在机制和评估针对特定基因突变的疗法。

该研究还表明，这些模型优于传统的脑肿瘤球体和二维胶质母细胞瘤细胞培养物，揭示了同一系统内肿瘤细胞和非肿瘤细胞之间的相互作用。同样，在胶质母细胞瘤领域，Junko Ogawa 及其同事领导的一项研究在人脑类器官中建立了胶质瘤癌症模型，用于研究癌症进展，特别是侵袭期。作者应用CRISPR/Cas9 技术通过 H9 hPSC 系中的同源重组将HRasG12V-IRES-tdTomato 构建体整合到TP53 基因中。有趣的是，突变细胞很快变得具有侵袭性并破坏了周围的类器官结构，进一步支持了这些肿瘤细胞的侵袭性。

同样美中不足的是，虽然从PSC产生的类器官在模拟疾病、确定新的治疗靶点和测试不同药物对肿瘤的疗效方面具有巨大的潜力，但仍需要考虑该技术在伦理方面的挑战。例如，存在被未分化干细胞污染的风险，类器官可能无法完全复制活生物体内复杂的细胞相互作用。而且，胚胎干细胞的使用存在一些伦理问题。

由多种细胞来源制成的类器官

类器官可以从不同细胞来源的混合物中产生，包括原代细胞、内皮细胞、基质细胞或肿瘤细胞系。在混合物中组合不同的细胞类型可以创建一个高度模拟体内TME。Yeonhwa Song及其同事使用多种细胞类型开发了一种类器官模型，例如肝细胞癌细胞、成纤维细胞（WI38细胞系）、肝星状细胞（LX2 细胞系）和内皮原代细胞系 HUVEC，以建立肝纤维化模型。该研究的目的是确定肝纤维化的潜在机制和抑制剂，表明抗纤维化药物可以改善组织通透性以支持抗癌药物的递送和疗效。

然而，从细胞来源的混合物中产生类器官在技术上具有挑战性，尤其是当需要混合的细胞类型具有不同的培养要求或不同的生长速率时。此外，类器官可能无法完全复制活生物体复杂的细胞相互作用，并且可能会因使用的细胞来源和制备方法而有所不同。

包括TME在内的类器官

在研究肿瘤微环境（TME）时，癌症类器官的应用存在局限性，它们通常缺乏免疫细胞的表现。因此，最近的研究集中在包括免疫细胞在内的癌症类器官的开发上。这些模型已被用于研究癌细胞与免疫系统之间的相互作用，并用于测试免疫疗法。通过加入免疫细胞及其分泌成分，这些类器官可以更好地模拟患者的TME，提供对癌症生物学的宝贵见解，包括免疫逃避和耐药机制。

癌症类器官中包含的一些常见免疫细胞，包括 T 细胞（细胞毒性或调节性）、NK细胞、巨噬细胞、树突状细胞 (DC)、髓源性抑制细胞 (MDSC) 或中性粒细胞。免疫细胞必须来自同一患者，以研究患者特异性免疫反应并防止同种异体反应。

因使用类器官研究癌症免疫疗法相对较新，包括免疫细胞在内的类器官的普遍使用仍然受限。关于如何使用这些模型来预测患者对治疗的反应，还有很多东西需要学习。而且人们总是担心类器官可能无法完全代表肿瘤及其免疫系统的体内生物学状态。

癌症球状体的生成和培养方法

无 ECM（细胞外基质）方法

无ECM方法是指在没有任何外部基质的情况下用于衍生和培养癌症类器官的技术。该方法依赖于细胞自我组织和产生自己的细胞外基质以及细胞与细胞和细胞与基质相互作用的能力。（图2)。

图 2. 不同 3D 细胞培养技术的示意图

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来源：参考资料[1]

用于培养癌症类器官的无支架方法有几个优点：它们促进细胞自然形成3D结构，这类似于天然组织结构。这有助于密切模拟细胞与细胞外基质之间的相互作用。该方法不依赖于特定细胞外基质蛋白的使用，更容易培养各种不同的癌细胞类型。无支架方法的另一个优点是它们更具成本效益，并且更容易进行大规模实验或用于临床应用。无支架方法具有可控的环境，例如氧气和营养水平，对细胞的生存和生长很重要。

癌症治疗研究的方法学选择

化疗

目前急需新的预测分析，来帮助患者匹配个性化的化疗方法。许多结果表明，PDO 可能反映了个体患者的临床反应。例如，一项研究从结直肠癌肝转移灶中提取了50个类器官，以评估PDO是否可以有效预测化疗反应和临床预后。50 个 PDO 暴露于 5-FU、CPT11 或奥沙利铂（常用的一线化疗药物），显示出对 5-FU、CPT11 或奥沙利铂单一疗法的动态化学敏感性。

CRISPR/Cas9

最近的研究表明，CRISPR/Cas9 技术可以去除致癌突变，从而实现结直肠癌的治疗。有趣的是，类器官可以从受某种遗传单基因疾病影响的个体患者身上分离出来，并且可以对类器官进行基因组编辑以纠正引起的突变。2013 年出现了第一个通过 CRISPR/Cas9 基因组编辑在患有遗传病的人类患者的干细胞中，纠正遗传缺陷的概念证明。 

除了纠正致病突变外，CRISPR/Cas9 已成为激活/停用肿瘤抑制基因和灭活致癌基因的多功能工具。此外，生成新类器官和细胞系模型的成功率大幅提高。这些进步使得应用新的 CRISPR/Cas9 技术和小分子数据库，来绘制实验室中多种罕见癌症类型的依赖关系成为可能，从而产生更强大的治疗预判。

过继性免疫细胞转移疗法

在过去几十年中，过继细胞转移 (ACT) 疗法发展较快。基于体外微加工和微流体技术的癌症模型 (iCoC) 能够在生理尺度上精确地操纵细胞、氧气运输、血管屏障和生物物理力的特殊位置。在最近的一项研究中，富集的肿瘤反应性T细胞显示出它们在体外杀死肿瘤类器官的效率。

CAR-T 细胞是另一种主要用于ACT的基因工程T细胞。肿瘤类器官芯片模型可以用于研究 CAR-T细胞的免疫活性。重现 3D 卵巢肿瘤的微型设备平台允许将肿瘤细胞暴露于 CAR-T 细胞递送并揭示细胞毒性。通过微流体乳腺癌细胞球体模型来研究NK细胞免疫疗法，一项研究观察到NK细胞单独或与抗体结合，能够在几个小时内直接穿透球体并破坏肿瘤细胞。NK细胞可以通过基因工程来表达CAR以增加它们的细胞毒性，并引导它们靶向肿瘤。

免疫疗法

与肿瘤微环境（TME）相关的失调，解释了为什么接受常规治疗通常会导致大多数侵袭性癌症类型的复发。因此，预测患者对特定治疗反应的情况是改善癌症治疗的关键。在过去十年中，免疫疗法在多种类型的癌症（包括黑色素瘤和肺癌）中显示出令人鼓舞的结果。然而，这些治疗并非对所有患者群体都同样有效。因此，TME的建模和分析是一个重要的参数，不仅要考虑新疗法的开发，还要考虑可能对它们有反应的患者的识别和分类。用于测试免疫疗法的3D细胞培养模型可以提供一种优雅的替代方法。

图3.类器官在癌症免疫治疗中的应用。

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来源：参考资料[1]

小结

综上所述，我们回顾了近年来肿瘤球状体和类器官技术的发展，以及各种类器官模型建立所取得的重要进展。我们还总结了类器官模型在肿瘤研究、癌症建模和治疗中的主要应用。肿瘤类器官模型可以接触不同的药物，筛选特定癌症的最佳治疗方法，以及个性化药物治疗疾病。有效增强预测能力，减少药物开发后期阶段的财务和时间成本，从而及早发现无效药物，以降低药物退出市场的风险。

虽然在类器官的临床研究道路上仍面临许多障碍，但我们预见类器官在临床前研究、药物筛选、免疫疗法预测和个性化医疗中的应用潜力巨大。作为一种研究工具，类器官还为多组学学科提供了独特的机会。

未来，将3D模型与高通量筛选方法、高内涵成像方法以及蛋白质组学和生物信息学工具相结合，将使这些模型成为药物开发和生物医学研究的基本工具，尤其是在免疫治疗领域，将大有裨益。

参考文献

[1]https://doi.org/10.3390/cells12071001

作者：摩西

排版：南风

本文仅为科普，谢绝商业用途的转载，严肃就医谨遵医嘱。

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