间充质干细胞与软骨再生

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一、引言

软骨损伤至今仍是临床尚未解决的难题，如何有效修复软骨组织，促进软骨再生，这始终是研究者的目标。软骨损伤最常见的病因来源于关节软骨的退变和磨损，尤以骨关节炎为代表。骨关节炎是一种常见的致残疾病，巨大的发病群体意味着昂贵的健康和社会经济成本，对患者和医疗保健系统都有显著影响。骨关节炎的发病机制复杂，软骨磨损是主因，在疾病进展过程中，微环境和遗传因素相互作用，最终导致关节软骨退化、关节内炎症和滑膜炎，以及软骨下骨变化。由于软骨细胞基本没有自身修复能力，局部组织往往被纤维瘢痕组织替代，或者处于失去软骨覆盖、软骨下骨的“裸露”状态。因此细胞替代治疗成为研究的方向，其中间充质干细胞（MSCs） 的细胞移植方法被认为是软骨细胞的潜在替代细胞来源，研究揭示了MSCs治疗软骨再生的潜力。国际细胞与基因治疗学会（International Society for Cell & Gene Therapy） 将MSCs视为具有显著的分泌、免疫调节和归巢特征的细胞群体。同时具备细胞黏附、表达特定表面标志物，能够体外分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞谱系的特征。动物实验和临床研究结果显示，MSCs可以平衡软骨的代谢活性和软骨分化。

MSCs是来源于成人组织的衍生细胞，具有旺盛的增殖能力和多向分化潜能。更重要的是MSCs致瘤风险很低，作为治疗用的种子细胞，具有可靠的安全性。MSCs具有向软骨细胞、脂肪细胞、成骨细胞、血管内皮细胞和肌纤维细胞在内的各种细胞谱系分化的能力。同时MSCs来源非常广泛，骨髓、脂肪组织、滑膜组织、肌肉组织等均可提取MSCs，提取方法简便安全，可操作性强。在MSCs向软骨细胞诱导过程中，需要生长因子的加入，包括转化生长因子-β（TGF-β）和骨形态发生蛋白（BMP）。MSCs还具有细胞迁移能力，可以结合至靶组织中发挥抗炎和免疫抑制作用，可能对骨关节炎或类风湿关节炎有治疗效果。动物实验表明，关节内注射MSCs和透明质酸确实可以促进损伤后的软骨再生。2008年，Centeno等将自体来源的骨髓间充质干细胞（BMSCs）注射到软骨/半月板退变患者的关节内，随访结果显示患者的疼痛症状和关节活动度有显著改善，MRI提示软骨组织出现修复反应。2010 年，Centeno所在研究团队将自体BMSCs在体外培养和扩增后，注射至227例患者的关节或椎间盘内，2年的随访结果未发现干细胞注射相关的肿瘤出现，这一结果说明MSCs无论在体外扩增阶段还是在体内治疗阶段，都显示出充分的安全性。

二、骨髓间充质干细胞（BMSCs）与软骨再生

在已有报道的MSCs来源中，BMSCs是最常用到的一类细胞，许多基础研究和临床研究已经证实了BMSCs在促进软骨新生方面的巨大潜能。在诱导分化时，BMSCs诱导后的软骨细胞可以产生大量含Ⅱ型胶原蛋白的细胞外基质，这非常有利于关节软骨的再生。动物实验表明，与单纯微骨折手术相比，BMSCs浓缩悬液局部注射与微骨折技术结合，用于马的全层骨软骨缺损，后者新生软骨的填充更好，且新生软骨的Ⅱ型胶原含量更高，提示了软骨再生的质量更好。另一项动物实验显示，局部注射BMSCs悬液对兔的骨软骨缺损有一定的修复效果，改用BMSCs复合支架材料植入骨软骨缺损处后，显示了更理想的软骨修复效果。这提示干细胞组织工程技术仍是软骨再生的重要手段和研究方向。临床研究方面，BMSCs包裹于自体骨膜制成的胶原凝胶中用于治疗髌股关节软骨缺损，术后随访4年的结果显示患者预后理想，实现了无痛行走。另一项研究分别对接受和未接受BMSCs移植治疗股骨髁内侧骨软骨缺损的患者进行随访，结果表明，患者具有相似的临床结果，但随访42周后的关节镜大体观察和组织学结果提示，接受BMSCs移植的患者显示了更理想的软骨修复和生长。然而，BMSCs作为软骨再生的种子细胞仍有缺陷，在体外扩增时或植入体内后，BMSCs可能会出现短时间内的过度增殖现象，这可能会造成细胞的提前老化，进而影响分化能力。另外，BMSCs的提取需要通过骨髓穿刺的方式获取，相比其他MSCs的提取， 这种侵入性的操作对供体区域的损伤更大。

三、脂肪间充质干细胞（ADSCs）与软骨再生

除BMSCs外， 脂肪间充质干细胞（ADSCs）是另一种MSCs的细胞来源，尽管其软骨分化能力较BMSCs略低，但细胞来源更丰富，并且更容易获取。上述优点使其成为软骨再生的又一潜在种子细胞，ADSCs在多种动物模型中都被证实具有软骨再生能力。动物实验显示，将BMP-14修饰的ADSCs负载于透明质酸水凝胶，局部移植到兔软骨缺损处，结果显示其可以显著促进缺损处透明软骨再生。然而， 基于安全性考虑，目前仅允许ADSCs以基质血管片段（stromal vascularf raction ， SVF ）的形式用于人类临床治疗。2001年，Zuk研究团队发现，SVF的脂肪组织内含有MSCs， 这些MSCs具有分化为软骨、骨骼、肌肉和脂肪组织的能力。2011年，Pak团队使用自体来源SVF形式的ADSCs， 同时复合富血小板血浆（PRP）和透明质酸（HA）成功治疗了2例膝关节骨关节炎患者，MRI显示2例患者的关节退变处出现软骨样组织的再生。ADSCs促进软骨再生的具体作用机制，目前仍处于研究阶段，可能的软骨再生机制包括：①ADSCs的旁分泌作用，分泌物包括各种细胞因子、趋化因子、生长因子，以及最近受到广泛关注和研究的细胞外微囊泡：外泌体（exosomes）。②ADSCs在植入部位的生长和分化，这种修复方式需要实验进一步证实。③上述两种效应的组合。另外，ADSCs的体外培养和扩增虽然更方便，但在全面的临床应用前，尚需要进行大量严格的临床试验进行验证方能获得批准。体外实验发现，ADSCs在诱导分化时，分化后的软骨细胞尽管可以产生大量胶原蛋白，但Ⅱ型胶原蛋白含量较低，这可能会使再生的软骨组织向纤维化方向发展，进而影响软骨修复效果。

四、滑膜来源的间充质干细胞（SDSCs）与软骨再生

有研究对比了来自不同部位的MSCs的软骨分化能力，结果表明，滑膜来源的间充质干细胞（SDSCs）优于骨髓、骨膜、骨骼肌和脂肪来源细胞。在体外多次传代后，SDSCs并未显示细胞变性或老化的迹象，说明其具备旺盛的细胞活力。动物实验显示，SDSCs可以促进大鼠半月板移植模型的半月板再生，并防止了关节软骨的磨损退变。然而SDSCs的缺点是来源少，获取困难，这限制了SDSCs在软骨再生领域的进一步研究和应用。将SDSCs与易于获取的MSCs进行共培养后再用于治疗，是一种可能的解决方案。动物研究显示，将SDSCs与ADSCs在体外共培养，扩增后注射到SD大鼠OA模型的膝关节腔内，结果显示其可以显著提升透明软骨相关基因的表达，同时抑制了炎症相关基因的表达量。

五、其他间充质干细胞与软骨再生

脐带基质组织中可以提取脐带间充质干细胞（UCMSCs），这种MSCs的免疫原性较低，具有更强大的多向分化潜能及细胞活力。与BMSCs相比，UCMSCs 具有更旺盛的扩增能力，体外生长更快，还可以合成不同细胞因子，作为治疗细胞， 已经在一些临床前动物模型中显示出理想的组织再生效果，如神经退行性疾病、癌症、心脏病等。动物实验将UCMSCs负载于4%的透明质酸水凝胶中，植入大鼠膝关节软骨缺损处，结果显示缺损处出现大量透明软骨新生，这初步证实了UC-MSCs的软骨再生能力。另外， 研究发现人类前交叉韧带和后交叉韧带（ACL、PCL）中也存在MSCs，这些MSCs 可以分化为软骨细胞、脂肪细胞和成骨细胞。韧带组织可以从全膝关节置换或交叉韧带重建手术中获取。这类MSCs在理论上也是软骨再生研究的重要细胞来源。

六、问题与挑战

MSCs用于软骨再生的临床治疗，还有大量研究需要完善，很多具体的问题需要研究者逐一解答。首先需要明确有效且安全的细胞移植方法：①干细胞注射的最佳剂量；②最佳注射模式；③促进干细胞黏附于软骨损伤处的最佳方法；④是否添加生长因子（例如PRP）；⑤理想的支架材料，如透明质酸（HA） 和细胞外基质（ECM）。其次， 细胞在体外处理时的老化和分化能力降低，需要通过更先进的手段来调控。最后，细胞的安全性尚需进一步临床研究来证实。
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来源：干就有未来

审校：咏彤

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