详尽综述：自然杀伤（NK）细胞疗法，选择哪种来源？哪种培养方式更优？

Original 摩西细胞王国

2024-11-24

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前言 /

自然杀伤（NK）细胞作为癌症治疗的一种有前景的免疫细胞治疗策略备受关注。与T细胞相比，NK细胞具有独立于MHC-I的肿瘤识别和低毒性的优势。本文概述了几种克优化NK细胞扩增方法和改善NK细胞抗肿瘤反应的策略。

比如最近的研究表明，通过诱导类记忆NK细胞、开发CAR-NK细胞或分离TILs，可以进一步提高NK细胞功能。总的来说，本文提供了NK细胞及其扩增方法的概述，重点介绍了临床试验的情况，和增强NK细胞免疫细胞治疗的关键进展。

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什么是自然杀伤细胞

自然杀伤（NK）细胞是一种大颗粒淋巴细胞，占健康成年人循环淋巴细胞的5-10%，在识别和清除转化和感染细胞方面发挥着关键作用。NK细胞通过不表达CD3和CD19、表达CD56、NKp46和NKp80来区分。NK细胞分为两个主要亚群：未成熟或调节性的CD56^bright CD16⁺/^-细胞和成熟或细胞毒性的CD56^dim CD16⁺细胞。CD56^bright亚群在淋巴结中更为普遍，在炎症环境中分泌细胞因子和趋化因子，招募和调节中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞和树突状细胞等免疫细胞。CD56^bright细胞可以在细胞因子的激活下迅速获得强大的细胞毒性功能。相反，CD56^dim亚群对肿瘤靶标具有更高的直接细胞毒性，通过CD16表达介导抗体依赖性细胞毒作用（ADCC），CD16与IgG1抗体的Fc区结合。此外，两种NK细胞亚群都通过表达FasL和TRAIL等死亡配体诱导肿瘤细胞凋亡。

图1. NK细胞亚群及NK细胞介导的免疫调节和细胞毒性机制示意图。（A）NK细胞根据CD56和CD16表面标记分类，包括调节或未成熟NK细胞（CD56bright CD16+/-），主要释放IFN-γ分子，以及细胞毒性或成熟NK细胞（CD56dim CD16+），主要释放穿孔素和粒粒体B分子。（B）激活的NK细胞，尤其是调节性NK细胞，在肿瘤微环境中释放免疫调节介质，如CCL5、XCL1、IL-8、IFN-γ、TNF-α和GM-CSF，招募和激活其他免疫细胞，包括中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞（DC）、T细胞和B细胞。（C）激活后，NK细胞通过FasL和TRAIL诱导的凋亡、穿孔素和粒粒体分子的脱颗粒，以及通过CD16介导的抗体依赖性细胞毒作用（ADCC），特别是细胞毒性NK细胞，结合肿瘤细胞上的抗体，诱导细胞凋亡，发挥细胞毒作用。

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NK细胞如何调节免疫反应

NK细胞有很多激活和抑制的“开关”，这些开关能影响它们的工作。激活的开关让NK细胞“动起来”，包括一些受体，它们能识别肿瘤细胞并启动攻击。相反，抑制的开关则让NK细胞“停下来”，防止它们攻击身体正常的细胞。

NK细胞的激活其实是通过激活和抑制信号的平衡来实现的。一种说法是，“丢失自我”假说，认为当肿瘤细胞上的某些标志物缺失或减少时，抑制信号会减弱，从而让NK细胞得以激活。另一种情况是，当感染或癌细胞上的一些应激信号增加时，NK细胞就会被激活。另外，有些“开关”也能限制NK细胞的活动，比如NKG2A、TIM-3、TIGIT和CD96等。虽然不常见，但在NK细胞中也会发现PD-1，这会导致它们在肿瘤内的功能失调。

图2. NK细胞的激活方式。

NK细胞的工作受到抑制和激活信号的影响。当NK细胞遇到正常细胞时，这两种信号保持平衡，NK细胞就保持不活跃。但是，当细胞缺少负信号的MHC-I分子时，NK细胞就会被激活，这称为“丢失自我”。此外，压力大的细胞，比如被肿瘤或病毒感染的细胞，会过度表达压力信号，这也能激活NK细胞。

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NK细胞有哪些来源及优点

CAR-T细胞已经大大推动了癌症治疗的进步。其他基于T细胞的方法，如TIL和TCR T细胞，也表现出了很好的疗效，已经得到FDA的批准。不过，T细胞疗法可能导致一些副作用，比如细胞因子释放综合征（CRS）、免疫细胞相关的神经毒性综合征（ICANS）和HLH，还有移植物抗宿主病（GVHD）的风险。与之相比，NK/CAR-NK细胞产品却没有这些副作用，因此成为了备受关注的替代选择。此外，NK细胞的来源多样，包括外周血、脐带血、造血干细胞和诱导多能干细胞，因此更容易获得，支持NK细胞作为T细胞的可行替代方案。下面我们来看一下NK细胞来源的主要优势和劣势。

外周血（PB）

外周血中的NK细胞大约占总淋巴细胞的5%到10%，具有高度成熟的特点，对肿瘤有强大的杀伤能力。在外周血NK细胞中，大约有10%是CD56bright亚群，其余主要是CD56dim NK细胞。通常通过白细胞分离技术从外周血单个核细胞（PBMC）中分离NK细胞。尽管外周血作为NK细胞来源方便获取，但存在一些限制，比如细胞数量相对较低和供体间差异较大。

脐带血（CB）

脐带血中NK细胞约占细胞总数的23%，与外周血中的CD56bright和CD56dim亚群比例相似。脐带血NK细胞的粘附分子和成熟受体表达较低，但与外周血NK细胞相比，关键的细胞毒分子的表达相似。尽管每单位脐带血中的NK细胞数量有限，但已经有成熟的扩增策略提供规模化的输注产品。此外，NK细胞也可以从脐带血中富含的CD34+造血干细胞分化而来，这些细胞与外周血NK细胞有很多相似之处。

胚胎和诱导多能干细胞

最新的科学进展已经实现了将人类胚胎干细胞（hESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）有效分化为高度功能的NK细胞（iNK细胞），与外周血NK细胞在功能和表型上有很多相似之处。iPSC-NK细胞表达了与外周血NK细胞类似的标志物，但其CD16表达较低，影响了其介导ADCC的能力。此外，iNK细胞的制备比较复杂，但也是一种潜在的来源。

图3. NK细胞的来源。

(A) 在外周血（PB）中，NK细胞占总淋巴细胞的5-10％，其中大约90％是CD56dim CD16+ NK细胞，剩下的10％是CD56bright CD16+/- NK细胞。

(B) 脐带血（CB）中的NK细胞可以直接从脐带血中获取，也可以通过暴露CD34+细胞于特定的细胞因子中分化而来。NK细胞在脐带血中占细胞总数的23％，脐带血NK细胞亚群的比例与外周血单个核细胞（PBMC）NK细胞相似。

(C) 人类胚胎干细胞（hESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）可以产生与外周血NK细胞在功能和表型上相似的NK细胞，尽管CD16的表达较低。

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NK细胞的扩增方法

尽管可以从多个来源获取临床级别的NK细胞产品，但数量仍然很有限。为了解决这个问题，以下几种扩增方法可以参考。

基于细胞因子的扩增

IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21等细胞因子对NK细胞的激活和调节至关重要，因此在各种扩增方法中被广泛使用。这些细胞因子能够促进细胞的存活、激活、溶解活性和细胞因子产生，以及提高细胞的毒杀作用。

表格1. 各种基于细胞因子的NK细胞扩增方法的扩增速率对比，包括来源、培养基、时间和培养材料。

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IL-2培养的PBMC可在21天内将NK细胞扩增了193倍。使用IL-2、OK432和抗CD16单克隆抗体（mAb）培养可获得76.9%的高纯度NK细胞，扩增倍数从数百到数千不等，尽管伴随T细胞的扩增。分离的NK细胞在IL-2培养下，初期NK细胞计数于第4天下降，但之后恢复。IL-15显示了NK细胞扩增的潜力，而IL-21触发了NK细胞在短期刺激下的成熟和功能性。采用IL-2、IL-15、抗CD3单克隆抗体、他克莫司和达肝素钠进行扩增时，脐带血NK细胞的纯度超过70%，扩增达到了1700倍以上。

基于饲养细胞的扩增体系通常包括使用不死化的或肿瘤细胞系与细胞因子结合，已成为扩增和激活NK/CAR-NK细胞的常见方法。使用Epstein-Barr病毒不死化淋巴母细胞系（EBV-LCL）作为饲养细胞，在IL-21刺激下，NK细胞可在一周内扩增了53倍，并且具有更优越的NK细胞细胞毒性。此外，脐带血NK细胞与EBV-LCL细胞共同培养35天后扩增了高达6092倍。来自晚期癌症患者的NK细胞与患病和健康供体的NK细胞去除PBMC共同培养。与使用患病供体细胞相比，使用健康供体细胞时可观察到更高的NK细胞扩增率。

饲养细胞的基因改动让NK细胞的扩增速率更高。比如，用IL-2培养的K562细胞可以让NK细胞扩增550倍，将NK细胞的比例从14.8%提高到86.7%。K562-mbIL15-41BBL细胞培养的CB-NK细胞可以实现35倍的扩增，并表现出更强的毒杀性。相反，使用K562-mbIL15细胞培养的NK细胞则端粒较短。而过表达mbIL-21的K562细胞（K562-mbIL21）能让NK细胞在6周内大规模扩增，而不出现衰老迹象。此外，与K562-mbIL21-41BBL细胞共同培养的iNK细胞纯度高达95.8%。另外，表达mbIL21的721.221细胞比K562-mbIL21细胞培养的NK细胞展现出更好的扩增、纯度和毒杀性。

K562-HLA-E饲养细胞能让NKG2C+记忆型NK细胞扩增超过1万倍。用OX40配体的K562细胞（K562-OX40L）再加IL-21刺激，NK细胞扩增可达2000倍，远高于仅用K562细胞培养的303倍。自体PBMC的饲养细胞也可用于扩增NK细胞，其中，放射治疗的自体NK细胞去除PBMC培养19天后NK细胞扩增了62.7倍。用IL-2和放射治疗的自体淋巴细胞培养的CB来源的CD56+细胞毒性细胞培养26天后扩增了156.3倍。用自体CD56去除的饲养细胞培养后NK细胞扩增了212倍，远高于仅用IL-2培养的22.5倍。再加入放射治疗的自体刺激T细胞，PBMC培养可实现90%纯度和约4720倍的NK细胞中位数扩增。

表2. 不同NK细胞扩增方法的对比，包括使用的饲养细胞、培养基、持续时间和培养材料。

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用于NK细胞扩增的培养材料

选择适当的培养材料非常重要，比如培养皿、袋子或生物反应器。在袋子和培养皿中培养的效应细胞，7天内的扩增、表型或功能上没有明显差异。但相比之下，在袋子中，NK细胞的扩增只有培养皿的一半。培养皿培养存在暴露和污染的风险，但可以在GMP实验室中将风险最小化。袋子培养则需要维持一定的细胞浓度，气体交换受到培养基容量的限制，影响了NK细胞的增殖。生物反应器操作简单，但通常需要更多的原始细胞数量，扩增速率也可能较低。

如何培养以提高NK细胞的活力

虽然NK细胞本身已经具备一定的细胞毒性，但在培养过程中可以进一步提升它们的活力。前面介绍了几种扩增方法，现在我们来看看在扩增过程中，NK细胞的表型、持久性和细胞毒性会发生哪些变化。

表型

NK细胞身上有各种激活和抑制受体，这些受体的表达在培养过程中通常会有所改变。例如，通过给予IL-2、OK432和抗CD16抗体，可以增加CD16和NKG2D的表达。而IL-2和IL-21的使用则会增加TRAIL、NKG2D和DNAM-1的表达。NK细胞培养在PBMC（外周血单个核细胞）中，会导致高水平的RANKL、B7-H3和HLA-II的表达，尤其是HLA-DR。使用K562-MICA-41BBL-IL15细胞培养的NK细胞，则表现出了更高水平的CD69、CD16、NKG2D和CXCR3表达。

端粒长度

端粒的缩短是限制NK细胞扩增的一个因素。通过与K562-mb15-41BBL细胞共同培养，NK细胞的端粒长度可能会缩短。为了解决这个问题，一些研究使用了人类端粒酶逆转录酶（TERT）的过表达，这样可以延长NK细胞的寿命，并保持高比例的细胞处于增殖期。通过与K562细胞和IL-2一起培养，NK细胞的STAT3磷酸化水平较高，这是人类TERT的激活剂。此外，使用K562-mbIL21细胞培养的NK细胞，其端粒长度增加、STAT3表达上调，并且老化现象减少。

细胞毒性

给NK细胞注入细胞因子和饲养细胞可以提高它们对抗肿瘤的能力。比如，一些细胞因子如IL-2和IL-12能促使NK细胞产生更多的干扰素-γ（IFN-γ），而IL-15和短暂暴露于IL-21则能增强NK细胞的杀伤能力和释放细胞因子的能力。一些特殊的细胞株，如K562-41BBL-IL15，能促进NK细胞的杀伤能力和IFN-γ的产生。而NK-92-OX40L细胞则分泌一种叫新细胞因子-2/15（Neo-2/15）的物质，可以增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

细胞培养的策略可以影响NK细胞的外观、功能和杀伤能力，进而影响到NK细胞治疗的效果。

其它提高NK细胞抗肿瘤的方法

虽然NK细胞在培养过程中的扩增和杀伤能力有所改善，但它们在临床上的应用仍然面临一些挑战，比如寿命短、肿瘤浸润少、体内存留时间短。为了进一步增强NK细胞的免疫治疗效果，我们可以采取一些关键策略，比如刺激记忆样NK细胞、基因编辑（比如CAR-NK细胞），以及最新的TIL-NK细胞。

记忆样NK细胞

NK细胞在受到细胞因子（比如IL-12、IL-15和IL-18）的刺激后，可能会变得像记忆细胞一样，对肿瘤产生更强的应对能力。这些记忆样NK细胞在实验动物和患者身上都显示出更高的增殖、杀伤能力和长期存留。它们在细胞内显示出一些特殊的标记，比如磷酸化STAT5，还表现出更强的杀伤效果，这使得它们成为免疫治疗的有希望选择。

嵌合抗原受体（CAR）技术

CAR技术就是改造免疫细胞，让它们携带一种人造受体，能够与肿瘤相关抗原结合，比如CD19（B细胞和淋巴瘤中都有）和BCMA（浆细胞中有）。虽然T细胞是CAR疗法中用得最多的免疫细胞，但会有一些问题，比如可能引发异体反应和GVHD，所以更倾向于使用自体T细胞。相反，CAR-NK细胞是从非自体来源获得的，可以提供“现成的”治疗产品，不会引起GVHD，也避免了大量细胞因子释放和神经毒性问题。

CD19-CAR-CIML NK细胞表现出增强的抗肿瘤活性，能够对抗对NK细胞不敏感的淋巴瘤细胞。最近，表达IL-15的CD19-CAR-CB NK细胞在治疗CD19阳性B细胞恶性肿瘤时表现出了安全和有效。在这项研究中，73%的患者对治疗有了反应，而且没有出现CRS、GVHD和神经毒性等毒性反应。CAR-CIML NK细胞也可以针对一种新的表位，这种表位产生在核仁蛋白-1（NPM1）突变的急性髓细胞白血病（AML）中，显示出很强的活性，能够在异种移植模型中改善AML的预后。

近期，有很多新的策略来改进CAR-NK细胞，比如CISH基因的敲除、促进代谢适应性、提高细胞扩增、增强抗肿瘤杀伤力、IL-15介导的STAT信号传导以及更好的NCR表达。此外，还有一些其他方法，比如通过阻断αv整合素来增强NK细胞对脑胶质瘤的作用，抑制TGF-β来增强抗肿瘤功能，以及通过CRISPR基因编辑来提高抗肿瘤效果。

肿瘤内的免疫细胞（TILs）和TIL-NK细胞

TILs主要是那些移动到肿瘤内部的免疫细胞，其中主要是T细胞。TIL疗法在治疗黑色素瘤患者时表现出非常好的效果，而在乳腺癌和结肠直肠癌等癌症的研究中也显示出潜力。最新研究表明，TILs中还包括NK细胞（TIL-NK细胞），它们与多种癌症患者的生存状况改善有关。

在肺癌中，TIL-NK细胞主要是一种称为CD56bright的类型，其杀伤肿瘤细胞的能力较弱，但在产生细胞因子方面与体外培养的NK细胞相似。在软组织肉瘤中，TIL中的NK细胞约占总数的20%。但在胰腺导管腺癌（PDAC）中，TIL-NK细胞却非常稀少。为了让更多NK细胞进入肿瘤，科学家们通过转基因技术增加了一种叫做CXCR2的特殊受体，使NK细胞能更有效地进入肿瘤组织。

尽管目前还没有明确的方法可以扩增TIL-NK细胞，但人们对这种治疗方法充满了期待。虽然TIL-NK细胞数量有限，但它们在肿瘤组织中的优越能力和与患者生存率改善相关的特性使其成为潜在的治疗方法。此外，最近美国食品药品监督管理局批准了一种名为Amtagvi的自体TIL疗法，用于治疗成人晚期黑色素瘤，这进一步证明了TIL疗法作为一种癌症治疗的前景。

正在开展的NK细胞疗法临床试验

目前，NK细胞的临床应用主要包括自体和异体两种方式。迄今为止，NK细胞的临床试验主要集中在血液病患者身上，但最近的临床前研究表明，它们也有望在实体肿瘤治疗中发挥重要作用。下面简要总结了一些关键的临床试验。

自体NK细胞

自体NK细胞被安全地用于体内扩增和输注，通过使用IL-2，但效果有限。一项I期试验显示，用K562-mbIL15-41BBL细胞扩增的自体NK细胞与曲妥珠单抗联合使用，使HER2阳性肿瘤患者的6例患者的病情持续稳定。另一项研究显示，将活化的自体NK细胞输注给多发性骨髓瘤患者后，该疗法的广泛可行性得到了支持。虽然在实验室研究中，体外激活的自体NK细胞存活时间延长，但在转移性黑色素瘤或肾细胞癌患者中并未观察到临床效果。这可能是因为自体肿瘤细胞缺乏KIR/配体错配或者移植后的自体NK细胞在体内存活能力有限。这些挑战是自体NK细胞治疗的重要障碍。目前，一些正在进行的临床试验正在评估自体NK细胞治疗对肝细胞癌和多发性骨髓瘤的疗效。

异体NK细胞

异体NK细胞的临床应用已经显示出对AML和多发性骨髓瘤患者的缓解和预防复发的作用。使用KIR错配供体NK细胞在半相合性造血干细胞移植后，显著降低了高危AML患者的复发风险。随后，对来自无关健康供体的异体NK细胞进行了在晚期淋巴瘤和实体肿瘤中的评估。在17名患者中，47.1%的患者表现出疾病稳定，突显了使用随机供体异体NK细胞的安全性和潜在疗效，从而扩大了供体细胞的选择范围。另一项研究显示，使用半相合性外周血单个核细胞对19名预后不良的AML患者进行治疗是安全的，并且在其中5名患者中诱导了完全缓解。类似地，通过使用IL-2激活的异体NK细胞结合抗CD20 mAb，在一个II期临床试验中，14名复发/难治性CD20+淋巴瘤患者中有14名患者获得了缓解。

考虑到异基因造血干细胞移植后复发的高风险，供体来源的CIML NK细胞在半相合性造血干细胞移植后复发的髓系恶性肿瘤中具有吸引力。一项人类首次I期临床试验中，使用供体CIML NK细胞治疗复发或难治性AML的患者，报告了9名患者中有4名达到完全缓解，1名达到形态学白血病无病状态（MLFS），总体反应率为55%，完全缓解率为45%。此外，CIML NK细胞的输注导致体内迅速10-50倍扩增，持续数月，支持将CIML NK细胞作为移植后复发髓系疾病治疗方式。这些发现突显了在输注前扩增和刺激NK细胞的重要性，无论是作为CIML还是常规NK细胞，以提高免疫治疗的有效性。

异基因脐带血NK细胞

首次人类试验中，使用IL-2和K562-mbIL21细胞扩增的脐带血NK细胞被输注给接受高剂量化疗和自体造血干细胞移植的多发性骨髓瘤患者。这项试验证明了安全性和有效性，8名患者中有10名达到了近乎完全缓解。此外，在复发性卵巢癌中，脐带血NK细胞显示出安全性和体内扩增能力。脐带血NK细胞产品oNKord已获得AML患者的批准。一项I期试验在老年AML患者中证明了其安全性和有效性，这些患者不适合进行异基因造血干细胞移植，而正在进行的II期试验则评估了oNKord对MRD患者的疗效。最近，进行了一项I/II期试验，评估了携带CD19-CAR和IL-15的脐带血NK细胞在CD19+ B细胞恶性肿瘤患者中的疗效。1年的总生存率和无进展生存率分别为68%和32%，患者的总反应与CAR-NK细胞水平较高和较长的持续时间相关。没有观察到明显的毒性，包括CRS和GvHD。

NK细胞疗法的未来

尽管NK细胞疗法有潜力，但仍存在挑战，如在癌症治疗中的低存活率和增殖能力不足。本文介绍了几种改善NK细胞功能的策略，包括扩增、细胞因子刺激和基因改造。通过使用不同的培养方法和细胞因子，如IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21，以及饲养细胞，已经实现了NK细胞的扩增和改变其特性。特别是，IL-2和IL-15的刺激有助于NK细胞的扩增，而IL-12和IL-21则增强了细胞毒性。此外，使用基因工程改造的饲养细胞，如K562-mbIL21细胞，也表现出显著的NK细胞扩增能力。

另一方面，生成记忆样NK细胞是改善体内存活性的另一种策略，它们具有更好的IFN-γ产生和细胞毒性。此外，NK细胞的基因改造已显示出良好的结果，比如增强了NK细胞的靶向性而不引起严重副作用。

探索TIL疗法，特别是TIL-NK细胞，为改善肿瘤治疗提供了一种有前景的替代方案。尽管在癌症治疗中取得了有希望的结果，但在实体肿瘤中使用NK细胞仍面临挑战，如肿瘤浸润能力差和高度免疫抑制的肿瘤微环境。有研究正在评估TIL的优越肿瘤浸润能力和开发新型的CAR工程细胞。

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作者：摩西

审校：暖风

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