南开大学发现：脐血NK细胞比外周血NK细胞更强！体外增殖及细胞毒性表现优秀！

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前言 /               

自然杀伤细胞（NK细胞）是一种在体内广泛分布的先天淋巴细胞（ILCs），在先天和适应性免疫反应中发挥关键作用。长期研究表明，NK细胞通过表达激活和抑制受体，在没有预敏化的情况下，对清除肿瘤细胞和病原微生物具有重要作用。

目前，外周血（PB）和脐带血（CB）被认为在自体和同种异体NK细胞移植中具有良好前景，然而在生物和分子水平上的相似性和差异大部分仍然不清楚。

为了评估两种来源的NK细胞的差异，南开大学的研究者从PB和CB中分离出单核细胞（MNCs），并通过流式细胞术和细胞计数比较了常驻NK细胞的生物表型。随后采用了已建立的“3ILs”策略和共培养进行NK细胞激活和细胞毒性分析。

最后，借助转录组分析，进一步解析了外周血NK细胞和脐带血NK细胞的特征。发现脐带血NK细胞在细胞活力方面优于外周血NK细胞，同时在亚群中存在变异。

脐带血NK细胞对肿瘤K562细胞的细胞毒性比外周血NK细胞更高。此外，研究者还发现两种NK细胞在基因表达谱和遗传变异方面都表现出多方面的保守和差异，包括基因亚组和信号通路。

总的来说，这两种NK细胞在细胞和转录组水平上都表现出多方面的相似性和不同的变异。这一研究的发现将有助于进一步探索脐带血NK细胞和外周血NK细胞的生物和转录组特性，以及NK细胞基础细胞治疗的发展。

研究具体结果及数据如下：

外周血显示出更高比例的NK，而脐带血则具有更强的扩增能力

为了剖析外周血和脐带血中驻留和激活的NK（rNK、aNK）的多方面生物学特征，研究者主要富集单核细胞（MNC），并进行基于“3IL”的 NK 细胞激活和扩增策略。（图1A）。直观上，驻留的外周血NK 和脐带血NK 都显示出典型的球状形态（第0天），然后是体外分化的聚集结构。

从围产期血液（PB）和脐带血（CB）中富集的单核细胞（MNCs）中比较驻留NK细胞。（A）在14天的体外诱导过程中，MNC来源的NK细胞在指示时间点（第0天、第7天、第10天、第14天）的代表性相位对比图像。比例尺=50微米。（B-D）流式细胞术（FCM）图表的代表性图示（B）和对PB来源的MNC（rPB-NK）和CB来源的MNC（rCB-NK）中CD3-CD56+（C）和CD3-CD56+CD16+（D）居住NK细胞（rNK）的统计分析。（E，F）在14天的体外诱导过程中，在指示时间点（第0天、第7天、第10天、第14天）对MNC来源的细胞总数（E）和CD3-CD56+ NK细胞（F）的统计分析。所有数据均以平均值±标准误差（N=3）显示。NS，不显著

通过流式细胞术检测，发现脐带血中驻留的NK细胞（第0天）比同时期的外周血更高（见图1B）。有趣的是，经过14天的扩增和激活后，脐带血NK细胞组中总NK细胞（CD3-CD56+）和总激活NK细胞（CD3-CD56+CD16+）的百分比分别高于外周血NK细胞组（见图1B-D）。通过进行活细胞计数，继续发现脐带血NK细胞组中MNC和总NK细胞的数量均高于外周血NK细胞组（见图1E，1F）。总的来说，脐带血NK细胞在体外扩增和激活方面表现出更强的活性，相比之下，外周血NK细胞则较为弱。

扩增的脐带NK细胞显示在激活和细胞活力方面比外周血NK细胞优越。

研究者首先初步验证了所示NK细胞的表型，接下来的目标是分析亚群体之间的相似性和变化。如流式细胞术图表和统计分析所示，驻留的脐带血NK细胞显示较高比例的NKG2A+ NK细胞亚群，但相比定居的外周血NK细胞，NKp46+亚群的比例较低。相反，与激活的外周血NK细胞相比，激活的脐带血NK细胞（第14天）观察到更高比例的NKG2D+、NKp46+和NKp44+亚群（图2A，2B）。

对扩增的NK细胞在数量和细胞活力上进行比较。（A，B）代表性的流式细胞术图表（A）和统计分析（B），显示了从第0天的定居NK细胞（rNK）到相应的第14天的扩增NK细胞（eNK）中NK细胞亚群（NKG2D+、NKG2A+、NKp46+、NKp44+）的百分比。（C，D）代表性的流式细胞术图表（C）和统计分析（D），显示了第14天的扩增外周血NK细胞（ePB-NK）和脐带NK细胞（eCB-NK）中凋亡NK细胞。（E，F）显示了ePB-NK和eCB-NK在细胞周期指示的亚阶段中的代表性分布（E）和统计分析（F）。所有数据均显示为平均值±标准误差（N=3）。NS，不显著；**，P<0.01；****，P<0.0001。

通过流式细胞仪检测，研究者发现外周血NK细胞组中7-AAD+Annexin V+凋亡NK细胞的比例高于脐带血NK细胞组，而7-AAD-Annexin V+和Annexin V+亚群的比例则呈相反趋势（见图2C、2D）。至于G0/G1、S和G2/M阶段NK细胞的指示亚群，两组之间几乎没有差异（见图2E、2F）。综合来看，激活的外周血NK细胞和脐带血NK细胞在亚群和凋亡细胞方面存在多样化差异。

扩增的脐带血NK细胞表现出比外周血NK细胞更高的细胞毒性。

为了分析两种NK细胞的细胞毒性，研究者将外周血NK细胞或脐带血NK细胞与髓系白血病细胞系K562进行共培养。如图3A、3B所示，在不同的效应器与靶细胞比率（E:T=3:1、1:1、1:3、1:5）下，脐带血NK细胞组中CD107a表达的NK细胞百分比低于外周血NK细胞组，在8小时内（见图3A、3B）。此外，脐带血NK细胞对K562肿瘤细胞的细胞毒性比外周血NK细胞在不同的E:T比率下更高（见图3C、3D）。综合而言，研究数据表明，脐带血NK细胞在对K562肿瘤细胞的细胞毒性上比外周血NK细胞表现出适度优势。

对扩增的外周血NK细胞和脐带血NK细胞在离体条件下对肿瘤的杀伤能力进行比较。（A，B）代表性的流式细胞术图表（A）和统计分析（B），显示了在不同效应器与靶细胞比率（E:T=3:1、1:1、1:3、1:5）下，与K562细胞系共培养的CD107a+扩增外周血NK细胞和脐带血NK细胞。（C，D）通过计算BV-421+细胞（C）和肿瘤细胞比例（D），比较扩增外周血NK细胞和脐带血NK细胞对上述K562细胞系的细胞毒性。所有数据均显示为平均值±标准误差（N=3）。NS，不显著；*，P<0.05；***，P<0.001。

扩增的脐带血NK细胞和外周血NK细胞在基因表达谱中的差异性

在比较了它们的生物学特性后，接下来转向验证脐带血NK细胞和外周血NK细胞在转录组水平上的相似性和变化。根据基因表达的箱线图和累积图，研究发现脐带血NK细胞和外周血NK细胞在基因表达谱上具有相似性（见图4A、4B）。通过主成分分析（PCA）显示，脐带血NK细胞和外周血NK细胞的分布没有明显倾向（见图4C）。

扩增的外周血NK 和脐带血NK 的基因表达谱的比较。(A,B)基于扩展的PB-NK(PB-1、PB-2、PB-3)和eCB中的TPM值，具有指定表达水平的基因数量的条形图(A)和累积图(B) -NK（CB-1、CB-2、CB-3）。(C) PCA 图表示基于 FPKM 值扩展的 PB-NK 和 CB-NK。(D) 维恩图显示了扩增的 PB-NK 和 CB-NK 中的基因数量。(E, F) 扩展的 PB-NK 和 CB-NK 中差异表达基因 (DEG) 的火山图 (E) 和热图 (F)。(G) Circos 图揭示了扩增的 PB-NK 和 CB-NK 之间具有遗传变异的融合基因的分布。(H) 直方图显示了扩增的 PB-NK 和 CB-NK 之间具有可变剪切事件 (VSE) 的基因的百分比。

根据Venn图和火山图，与外周血NK细胞相比，脐带血NK细胞中分别上调了622个基因和下调了834个基因（见图4D、4E）。有趣的是，研究者还观察到外周血NK细胞（PB-1、PB-2、PB-3）和脐带血NK细胞（CB-1、CB-2、CB-3）在组内表现出更强的聚类关系（见图4F）。同时，根据Circos图和VSE图，没有发现外周血NK细胞和脐带血NK细胞在基因的分布或可变切割事件（VSE）上有明显差异（见图4G、4H）。总的来说，研究数据表明了基因表达谱和遗传变异中的保守性和多样性差异。

结论：

1、自然杀伤细胞（NK细胞）可以从多种来源生成，如外周血、脐带血、胎盘血、骨髓、造血干细胞（HSCs）、胚胎干细胞（ESCs）、诱导多能干细胞（iPSCs）甚至NK细胞系（例如NK-92、YT）。

2、与存在外周血NK细胞扩增限制的骨髓不同，干细胞（如HSCs、ESCs、iPSCs）和NK细胞系可以用于大规模均质NK细胞的生成，但存在各种缺陷（如高成本、细胞毒性不足、由于分化效率引起的潜在安全隐患）。

3、相反，脐带血和外周血被认为具有多种优势和可取的异基因NK细胞制备前景。一般来说，脐带血中NK细胞在单个核细胞（MNCs）中的比例少于5%，而外周血中在5%至20%的MNCs中存在NK细胞。

4、纵向研究已经表明外周血NK细胞在杀伤广谱肿瘤细胞方面具有独特的能力，因此在临床实践中被认为是NK细胞生成的主要成分，但在稳定性和产量方面存在限制。最新的文献已经转向脐带血进行大规模NK细胞生产，因为生成的脐带血NK细胞显示出强烈的溶解活性。

5、在本研究中，特别是脐带血NK细胞显示了更可取的离体扩增和细胞活力，并且对比外周血NK细胞具有增强的细胞毒性。通过RNA-SEQ分析，研究者验证了扩增的外周血NK细胞和脐带血NK细胞在转录组水平上包括特定基因表达模式和信号级联（如TNF-α信号、NF-κB信号、AMPK信号、KRAS信号、补体）和基因变异（如VSE）方面的多方面相似性和变化。

6、有趣的是，该研究还注意到与驻留NK细胞相比，激活NK细胞进一步活化，进一步表明“NK细胞教育”对NK细胞功能成熟具有重要作用。

参考资料：

作者：摩西

编辑：暖风

声明：本文不构成任何建议，文章版权归原作者所有

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