近日，四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室石虎兵教授团队联合四川大学华西医院马学磊副教授在在权威刊物《Cancer Cell》发表一篇题为“Immune checkpoint HLA-E:CD94-NKG2A mediates evasion of circulating tumor cells from NK cell surveillance” 的研究论文，该研究发现CTCs和自然杀伤细胞(NK)通过免疫检查点分子对HLA-E:CD94-NKG2A相互作用。通过阻断NKG2A或抑制HLA-E表达来破坏这种相互作用可以增强NK介导的体外肿瘤细胞杀伤，并在体内防止肿瘤转移。机制研究表明，血小板源性RGS18通过AKT-GSK3β-CREB信号通路促进HLA-E表达保护CTCs免受NK介导的免疫监测。
这篇文章登上了Cancer Cell的当期封面，而封面内容正是每个人都耳熟能详的“三打白骨精”。
图源：Cancer Cell
在这张封面图中，以白骨精指代CTCs，通过迷惑唐僧（血小板）和猪八戒（HLA-E），使其阻止孙悟空（NK细胞）的攻击。
近年来，随着人们对肿瘤免疫逃逸的认知，免疫检查点阻断疗法已经彻底改变了多种癌症的治疗模式。目前，实体肿瘤原发或转移灶肿瘤微环境中肿瘤细胞与不同类型的免疫细胞之间的免疫检查点分子已经得到了广泛的研究。原发灶肿瘤脱落的循环肿瘤细胞（CTCs）被认为是肿瘤远端转移的关键细胞。由于血液循环是肿瘤细胞从原发灶向远端转移的主要途径，研究CTCs与血液中免疫细胞之间的相互作用可能提供一种通过激活宿主免疫系统来阻断转移的策略。然而，目前关于CTCs在血液中如何逃脱宿主免疫监视的机制尚不清楚，也缺乏有效的抑制CTCs转移扩散的治疗方案。
在这篇文章中，首先，研究人员通过计算机断层扫描和肿瘤标志物对6例未接受治疗的PDAC患者进行肝转移筛查，并使用腹腔镜设备采集HPV血液、原发性和肝转移性病变的活检，然后进行组织病理学验证。外显子组测序显示原发肿瘤和转移性肿瘤的拷贝数变异(CNV)、驱动突变和单核苷酸变异分布模式相似。此外，通过基因组学技术获得了原发和转移性肿瘤活检以及CTC的转录组(图1A)。为了描述PDAC转移过程中转录特征的改变，研究人员利用CopyKAT从上皮细胞群中定义肿瘤细胞，并将其与CTC一起在t-SNE图上展示：实体病灶的肿瘤细胞主要由患者聚集，表明患者间异质性明显。差异基因表达(DGE)分析和转录组相关分析显示原发和转移性肿瘤细胞之间高度相似的表达模式。相反，即使来自不同患者的CTC，也会落在一个集群中，与实性病变来源的肿瘤细胞分离得很好。DGE分析显示大量血小板相关基因在CTC中显著富集，但在实体病变的肿瘤细胞中不富集(图1D)。令人惊讶的是，在CTC中过表达最多的100个基因中，有32个被鉴定为血小板相关基因。作为典型特征，在CTC人群中观察到EMT相关基因的上调和上皮基因的丢失(图1D)。此外，GPCR家族基因RGS18、NRGN、GNG11、CCL5等在CTC中表达显著上调，而核糖体相关基因表达显著下调。这些特异性表达的基因使得CTC在所有测试患者中都具有“独特”的特征。CluGO的生物特征表征揭示了CTC特异性的特征，包括免疫相关信号、血小板相关信号、致癌信号、细胞周期、凋亡、代谢、EMT、RNA和生物合成，基因集富集分析显示了每个类别的主要特征(图1E)。DGE分析结果显示，血小板相关特征和生物大分子合成特征分别显著上调和下调基因集。尤为重要的是，与原发和转移性肿瘤的CTC人群相比，免疫相关信号更活跃，这意味着CTC与循环中的免疫细胞之间存在潜在的相互作用(图1E)，这种相互作用反映了来自宿主免疫系统的监视和CTC的免疫逃避。图1：单细胞水平上PDAC原发肿瘤、转移病灶和CTC的转录组特征为了描述CTC的特异性免疫相关行为，该团队以胰腺导管癌（PDAC）肝转移为模型，并基于CellPhoneDB研究配体-受体对在肿瘤细胞表面和各亚型免疫细胞表面的分子相互作用。研究发现，在原发/转移病灶的微环境中，肿瘤细胞与多种类型的免疫细胞如CD8+ T细胞、巨噬细胞、NK细胞等之间存在复杂而密集的相互作用，其中CTCs和NK细胞之间相互作用明显。值得注意的是，在循环中的CTC和免疫细胞之间观察到一种独特的免疫检查点分子对模式。在这些相互作用的分子对中，HLA-E和CD94-NKG2A被认为是CTCs和NK细胞之间最强烈的免疫相互作用。细胞-细胞接触富集实验进一步表明，HLA-E过表达显著改善了NK细胞的粘附，而NKG2A阻断抗体monalizumab则反向减弱了NK细胞的粘附。这表明肿瘤细胞以HLA-E依赖的方式与NK细胞结合。这些数据表明CTC可能通过招募HLA-E:CD94-NKG2A来逃避循环中NK细胞的免疫监视。为了确认CTCs是否通过HLA-E:CD94-NKG2A检查点逃脱NK细胞监视，深入研究发现HLA-E保护PDAC SU86.86细胞不受患者来源的NK细胞影响(图2A)。而HLA-E的抑制可有效地使PDACs对NK细胞杀伤敏感。Western blot显示，典型的免疫检查点信号SHP-1被抑制，而功能酶GZMB在与HLA-E缺陷肿瘤细胞共培养系统分离的NK细胞中上调(图2B)。为了在体内验证这种免疫检查点功能，研究人员通过尾静脉注射荧光素酶标记的小鼠PDAC细胞KPC来重现CTC介导的转移，该细胞理论上表达人HLA-E的小鼠同源蛋白分子H2-T23。为了分析抗体阻断时对肺转移的影响，在此之前分别对KPC-Luc细胞开始了抗体治疗(第-1天)，接种时(第0天)，接种后(第1、3、5天)，每天共注射4剂NKG2A阻断抗体(图2C)，第15天用生物发光成像系统对肿瘤肺转移进行可视化和定量分析(图2D和2 E)。结果表明，抗NKG2A阻断抗体能够抑制肿瘤转移，且具有时间依赖性。越早阻断NKG2A，越能有效预防转移。在接种肿瘤前阻断NKG2A可显著防止肿瘤转移，而在0天和1天启动的阻断仅部分阻碍肿瘤转移。第3天(第3和第5天)后，NKG2A阻断不再能阻止转移(图2F-2H)。这意味着HLA-E:CD94-NKG2A中断的抗肿瘤作用仅局限于在血液循环中流动的肿瘤细胞，而不是已经在转移器官中定居的肿瘤细胞。为了验证这一推测，研究人员用GFP标记模拟了肺转移过程中KPC肿瘤细胞的沉降过程。除了阻断NKG2A外，研究还通过在接种KPC细胞前抑制H2-T23的表达来中断分子对的相互作用。与抗体阻断的结果一致，生物荧光定量、肿瘤淋巴结计数、H&E染色病理分析均显示H2-T23 (HLA-E)下调可明显缓解肺转移(图2I-2M)。此外，将具有免疫功能的小鼠C57/BL6作为受体也验证了这一现象(图2N)。这些结果证实了HLA-E:CD94-NKG2A在血液循环转移过程中的免疫检查点功能。此外，Kaplan-Meier估计显示，阻断NKG2A和抑制H2-T23均可显著提高肺转移小鼠在接种肿瘤后27天的总生存率(图2O)。因此，这些结果表明HLA-E:CD94-NKG2A是一种潜在的免疫检查点，介导循环中NK细胞监测中CTC的逃避。图2：免疫检查点HLA-E:CD94-NKG2A的体内外功能验证那么CTC是如何调动HLA-E的表达？该团队评估了与HLA-E表达水平潜在正相关的差异表达基因。根据折叠变化、p值和相关指数排序，我们鉴定出一系列HLA-E相关基因，包括PPBP、PF4、NRGN、RGS18等(图3A)。将这些基因导入两种PDAC细胞系SU86.86和CFPAC-1后，HLA-E表达水平上调。其中RGS18最强(图3B)。为了验证RGS18在CTC中的上调，研究人员通过免疫荧光染色检测了所有6例接受scRNA-seq的患者活检中的RGS18蛋白。发现RGS18几乎只在CTC中表达，而不是在原发和转移性病变的肿瘤细胞中表达(图3C)。紧接着，该团队探讨了RGS18如何调节HLA-E的表达。RGS18是R4亚家族蛋白，具有负调控作用。在RGS18过表达的PDAC细胞中，通过western blots检测GPCR信号通路Gai和Gaq.20-22。通过检测关键激酶的磷酸化，发现AKT途径被RGS18过表达特异性地干扰(图3D)。RGS18上调后，AKT磷酸化下调。随后，GSK3b通过抑制丝氨酸残基9磷酸化而稳定(图3D，左)。然后GSK3b通过磷酸化丝氨酸残基129来增强CREB1的活性。被激活的CREB1显示出细胞核优先亚细胞定位模式(图3E)。在细胞核中，CREB1与RFX和NFY形成转录正调控复合物，结合HLA-E的启动子结构，该结构由完整的SXY模块和不完整的增强子A和ISRE位点组成。与这些结果一致地是，CREB1的下调显著下调HLA-E的表达(图3)。相反，在SU86.86和CFPAC-1细胞中敲除RGS18可增强AKT的磷酸化并破坏GSK3b的稳定。随后，它使CREB1失活并下调HLA-E表达(图3D，右)。PDAC细胞中的KTE17K和AKTQ79K抑制GSK3b，下调CREB1，进而降低HLA-E的表达(图3G)。综上所述，信号通路探索表明RGS18通过AKT- GSK3b-CREB1轴促进HLA-E的表达。图3：RGS18通过AKT-GSK3b-CREB1轴促进HLA-E在CTC上的表达为了验证RGS18的促转移功能，研究人员通过脾内注射荧光素酶标记的SU86.86 PDAC细胞和系统应用人NK细胞，概括了HPV肝转移的过程(图4A)。RGS18过表达的SU86.86细胞接种小鼠后，生物荧光图像和信号定量显示肝转移主要发生在肝脏解剖部位(图4B和4C)。相反，空白载体SU86.86细胞接种对照组小鼠，未见明显肝转移。通过检查解剖的肝脏器官，观察到在接种了人RGS18 (hRGS18)过表达PDAC细胞的小鼠中发现了严重的转移性肿瘤，而在对照组中没有发现(图4D)。H&E染色和免疫组化检测人EpCAM和RGS18进一步证实了这一结果(图4E)。在另一项独立实验中，RGS18过表达显著降低了肝转移小鼠的总生存率(图4F)。此外，生物发光成像和信号定量结果显示mRGS18通过上调H2-T23显著促进肺转移(图4G, 4H)。而在瘤接种前1天给予NKG2A阻断抗体（1天四次）可以抑制转移(图4I-4K)。总之，这些数据表明RGS18通过上调CTC中抑制性免疫检查点HLA-E的表达，从而在促进肿瘤转移中发挥关键作用。综上所述，该研究在单细胞水平上揭示了阻断免疫检查点HLA-E:CD94-NKG2A可抑制肿瘤转移。该研究为治疗肿瘤转移提供了新的靶点，并且提出靶向免疫检查点HLA-E:CD94-NKG2A抑制肿瘤转移的新策略。
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