Nature | 单细胞+时空转录组，揭示肺部免疫反应的关键
他山之石，可以攻玉。单细胞及时空组相关技术正在引领生命科学领域新一轮的科技革命，相关研究文献产出更是呈井喷之势。接下来，华大时空会不定期解读以上领域的经典文献，提炼精华，帮助大家了解前沿科研资讯，培养系统科研思维。
单细胞和空间转录组是目前研究的热点技术，已发表多篇高影响力的文章。美国圣犹大儿童研究医院的Paul G. Thomas团队通过单细胞+空间转录组+功能实验验证，揭示了肺部成纤维细胞在病毒感染期间的肺部免疫反应中起重要作用，进一步探讨以此作为临床治疗靶标的可能性。该文于2020年10月28日发表于Nature，标题为“Exuberant fibroblast activity compromises lung function via ADAMTS4”。
文章题目：Exuberant fibroblast activity compromises lung function via ADAMTS4
发表时间：2020-10-28
发表期刊 ：Nature
第一作者：David F. Boyd
通讯作者：Paul G. Thomas
主要研究团队：美国圣犹大儿童研究医院、美国波士顿儿童医院等
影响因子：49.962
DOI：https://doi.org/10.1038/s41586-020-2877-5
文章解读
研究背景
呼吸道感染是导致疾病和死亡的主要原因，严重的呼吸道感染可以导致急性呼吸窘迫综合症（ARDS）。目前，没有药物可以显著改善ARDS患者的预后。病毒感染引起的肺部损伤大部分是由于免疫细胞浸润的结果，免疫细胞会清除感染细胞及邻近细胞，所以进一步了解病原体清除和免疫反应之间平衡的机制可能有助于确定改善ARDS预后策略。已有大量关于免疫细胞如何调节宿主对呼吸道病毒感染的反应的研究，但关于非造血细胞的异质性和作用的信息较少，所以本文重点研究非造血细胞在病毒感染的免疫过程起到的作用。
研究思路
研究通过流感病毒感染小鼠，收集肺部组织进行单细胞测序，确定病毒感染期间肺部组织的细胞类型，发现免疫类成纤维细胞在感染期间数目增加。通过病毒感染后的支气管上皮细胞与成纤维细胞共培养或者细胞因子/病毒单独培养的方法，确定为成纤维细胞提供免疫信号的信号分子和活化的成纤维细胞ECM相关基因的表达情况，确定Adamts4基因在感染过程的表达情况及表达部位。通过构建Adamts4基因敲除的小鼠，验证该基因在流感病毒感染的免疫过程所起的作用及对肺功能的影响。最后通过人群队列分析确认Adamts4基因与疾病严重程度的关系（图1）。
图1 文章研究思路
研究结果
1. 流感病毒感染后肺部基质细胞的反应
流感病毒感染小鼠0、1、3、6天后收集肺部组织，分离出CD45−的细胞进行单细胞测序（图2-a）。肺部组织包含了多种细胞类型，其中成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞是主要的细胞类型，占细胞总数的绝大多数（图2-b）。研究发现感染后的成纤维细胞出现多种转录状态，通过和感染前就存在的cluster5进行差异功能分析，成纤维细胞可分为3个功能大类：炎症型、ECM合成型、静息型（图2-c，d）。炎症型的成纤维细胞富集炎症相关通路的基因，包括I型干扰素、白细胞介素6(IL-6)或NF-κB信号传导等；ECM合成型富集ECM蛋白合成的通路，但缺乏炎症性特征；而静息型则没有这两类基因的特征（图2-e）。炎症型成纤维还可以细分为损伤响应型和干扰响应型。人肺部组织的成纤维细胞分类与小鼠的一致。
通过流式细胞分析结果发现，在流感病毒感染期间，损伤响应型成纤维细胞在整个病毒感染期间增加，感染12天时达到顶峰；干扰反应型成纤维细胞在感染第3天达到顶峰后开始下降；静息型成纤维细胞没有显著增加（图2-g，h）。结果说明在流感病毒感染期间，肺部成纤维细胞处于损伤应激状态。
图2 严重的甲型流感病毒感染期间CD45-细胞的基因表达谱（来源正文Fig. 1）
2. 成纤维细胞活化的调节
为了确定调节成纤维细胞活化的上游刺激物，文章通过病毒感染（1种流感病毒了2种禽流感病毒）正常支气管上皮细胞（NHBEs）与成纤维细胞共培养，看是否能启动成纤维细胞的炎症转录程序。
结果发现感染的NHBEs能诱导成纤维细胞表达炎症状态的基因，同时还上调ECM、缺氧、基质蛋白酶和TIMPs基因的表达。细胞因子和病毒单独与NHBEs培养，看NHBEs基因表达情况。结果发现NHBEs对IL-1和TNF具有高度的响应，并能上调ECM相关基因的表达（图3-a）。这说明可能是IL-1和TNF向成纤维细胞提供免疫信号，从而调节ECM相关基因的表达。
3. 活化成纤维细胞中的ECM蛋白酶基因变化
为了确定是否有个别的蛋白在肺部损伤修复中起作用，研究收集了流感病毒不同感染时间的肺匀浆液评估ECM相关基因的表达情况。ECM相关基因可以分析3类：一类是在整个感染期间持续表达，一类是在感染后修复期高表达，一类是在修复期高表达。Adamts4，降解多功能蛋白聚糖的酶，在感染早期就被诱导表达，且在整个感染期间持续表达（图3-b）。在单细胞结果中，该基因也只在成纤维细胞、周细胞、平滑肌细胞和淋巴内皮细胞表达（图3-c）。在病毒感染后，该基因只在成纤维细胞的表达量显著上升（图3-d）。通过时空转录组分析，发现损伤响应型成纤维细胞主要分布在炎症间质区，而Adamts4的表达则仅限于肺泡附近的炎症间质区（图3-e）。
图3 流感病毒诱导肺部成纤维细胞衍生的ECM蛋白酶Adamts4（来源正文Fig. 2）
4. Adamts4导致致命性免疫反应
为了确定Adamts4基因对宿主免疫的影响，研究构建了Adamts4突变小鼠（Adamts4−/−）。与正常的野生型小鼠（Adamts4+/+）比较，突变型的小鼠对致死量的病毒感染具有更长的生存期（图4-a）。虽然两者的肺部病毒感染面积没有显著的差别，但突变型小鼠具有更好的肺部功能（图4-b，c）。突变型的肺泡免疫情况、隔膜厚度、纤维化情况都显著低于野生型（图43-d），且炎症因子的表达情况也低于野生型，最终导致突变型的肺功能要好于野生型（图4-e）。该结果说明Adamts4基因确实能减少流感病毒感染引起的宿主免疫反应，从而减少肺部功能的损伤。
CD8+ T细胞是流感病毒感染期间免疫病理学的主要驱动因素之一，病毒特异的CD8+ T细胞（tetramer+ CD8+）在两类小鼠中没有显著的区别，说明流感病毒在两类小鼠中均引起了免疫反应，而IFNγ+ CD8+ T细胞则在野生型小鼠中显著高于突变型小鼠（图4-f，g）。病毒感染的肺切片中，突变型小鼠的T细胞数量少于野生型，且T细胞不出现在多功能蛋白聚糖完整的区域（图4-h）。研究进一步通过实验，验证了突变型的成纤维细胞能够显著阻止T细胞迁移穿过多功能蛋白聚糖屏障，并且也只有高表达Adamts4的损伤响应型的成纤维细胞促进T细胞迁移穿过多功能蛋白聚糖屏障（图4-i，j）。这说明高表达Adamts4基因成纤维细胞可能通过该基因降解多功能蛋白聚糖，从而使得T细胞进入肺部组织，引起更强烈的免疫反应。
图4 Adamts4促进小鼠甲型流感病毒感染期间的致命性免疫病理变化（来源正文Fig. 3）
5. Adamts4和人类的严重流感
为了研究Adamts4与人类严重流感的关系，本研究从儿科重症监护流感（PICFLU）网络收集了84个儿科重症监护流感个体入院72小时的器官内吸出物，分析炎症因子和ECM蛋白酶、TIMPs水平的关系。结果显示Adamts4与炎症因子TNF、IL-1B及IFNγ（Adamts4充足的小鼠在病毒期间CD8+ T细胞更高频表达）呈正相关（图5-a）。且Adamts4的表达量与PrMODS、PrAHRF和VFDs严重的疾病后果呈正相关（图5-b）。在成人队列中也观察到了相似的结果（图5-c，d）。这说明Adamts4与流感的严重程度有关。
图5 Adamts4水平与严重的季节性和禽流感感染有关（来源正文Fig. 4）
总结
文章通过单细胞测序发现，呼吸道病毒感染能诱导肺成纤维细胞不同的激活状态，包括ECM合成、损伤响应和干扰响应状态。在病毒感染期间，通过时空转录组测序发现损伤响应型成纤维细胞定位在炎症间质区，并过度活动驱动了宿主的免疫反应，通过产生ECM重塑酶，特别是ECM蛋白酶ADAMTS4和炎症细胞因子改变肺部的微环境，以牺牲肺功能为代价促进强大的免疫浸润。
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